【J. Am. Chem. Soc.】核黄素生物合成途径中3,4-二羟基-2-丁酮4-磷酸合酶RibB的催化机制研究

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3,4-二羟基-2-丁酮4-磷酸合酶RibB是一种镁依赖性酶,在D-核酮糖-5-磷酸(D-Ru5P)的C4位置切除一个甲酸盐分子生成四碳底物,该底物用于二氧四氢蝶啶合酶催化,作为二氧四氢蝶啶的二甲苯部分,最终形成核黄素异四氧嘧啶。早在20世纪90年代科学家就首次发现了该反应,尽管直接证据很少,但推测的该反应化学机制具有一定的认可度。




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图片来源:J. Am. Chem. Soc.



为了获得更多的证据探究这一反应机制,University of KansasAudrey L. Lamb课题组以霍乱弧菌RibB为研究对象,利用多种生物化学方法对其催化过程进行了进一步地表征。蛋白晶体结构显示,RibB具有标准的α+β结构,其中α-螺旋堆积在中心β-片的两侧。活性位点周围有两个可活动的loop。较短的loop 1由对底物和金属离子结合很重要的酸性残基组成。较长的loop 2显示了与底物和金属结合的构象灵活性。



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通过酪氨酸荧光扰动、活性测定和电子顺磁共振(EPR)的研究手段,结果显示RibB利用单核镁离子中心进行催化。



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此外,研究结果显示,RibB的活性依赖于pH,这与镁离子结合有关。



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通过锰重组酶的电子顺磁共振以及与锰离子和多种糖磷酸盐结合的晶体结构表明,在金属离子浓度等于酶浓度时,可以实现RibB的完全活性。



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通过对单循环反应的酸淬灭结合核磁共振对单个和完全13C标记的D-Ru5P进行鉴定,确定了产物形成之前的两种瞬态物种。这些数据表明,C1的脱水形成了第一个瞬态物种,该物种通过1,2迁移进行重排,将C5融合到C3,并生成水合C4并准备作为甲酸盐消除,证明了从5-D-核酮糖5-磷酸中切除4-碳后发生1,2-位移的假设。



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总的来说,这些数据首次揭示了RibB催化机制中关键的瞬态化学状态。


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参考文献:Evidence for the Chemical Mechanism of RibB (3,4-Dihydroxy-2-butanone 4‑phosphate Synthase) of Riboflavin Biosynthesis

J. Am. Chem. Soc.

DOI: 10.1021/jacs.2c03376

原文作者:Nikola Kenjić, Kathleen M. Meneely, Daniel J. Wherritt, Melissa C. Denler, Timothy A. Jackson, Graham R. Moran, and Audrey L. Lamb*



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