分享一篇近期发表在J. Am. Chem. Soc.上的研究进展，题为：Introducing Azomethine Imines to Chemical Biology: Bioorthogonal Reaction with Isonitriles。该工作的通讯作者是来自苏黎世联邦理工学院的Helma Wennemers。

    偶氮次甲基亚胺（AMIs）在合成化学中有非常广泛的应用，如用于含氮杂环的合成、不对称催化等。生物正交连接可用于生物分子的标记和成像，或用于治疗工程，如抗体-药物偶联物，这些反应需要在生理条件下具有化学选择性，快速形成稳定的产物，利用小的反应基团连接在生物分子上。为了允许同时进行多靶点标记，理想情况下，任何新的生物正交反应都应该与常见的环加成反应正交，例如，应变促进的叠氮化-炔环加成反应(SPAAC)和逆电子需求Diels - Alder环加成反应(iEDDA)。

    用于多肽的功能化AMI与广泛的亲偶极试剂和亲核试剂反应通常需要严格的无水有机溶剂环境。本文作者将AMIs的应用拓展到了复杂水环境中的生物正交反应，证明了C, N-环状-N ' -酰基AMIs（图1B）在水环境中是非常稳定的1，3偶极子，并与异腈发生化学选择性反应，AMI -异腈连接速度很快(k₂ = 0.1−250 M⁻¹ s⁻¹)且与已建立的SPAAC和iEDDA连接正交。

图1. AMIs与异腈在水溶液中的生物正交反应

    首先，作者评估了AMI 1的反应性和稳定性，在柠檬酸-磷酸盐缓冲液(CitPhos-d₂)/DMSO-d₆=9:1、 pH=7的水溶液中，没有观察到醛和肼的水解。加入异腈2，在37℃条件下12h定量获得连接产物3。在谷胱甘肽（GSH）存在的情况下，观察到反应产物4，并随着时间的推移水解为产物3。这些结果证明了AMI -异腈连接具有良好的化学选择性。作者进一步研究了AMI 1和连接产物3在生理条件下的稳定性，并将其与广泛使用的生物正交试剂DBCO-amine 5和3,6-dipyridyltetrazine 6进行了比较。高效液相色谱分析显示，AMI 1和连接产物3在细胞裂解液(蛋白浓度为1 mg/mL)和GSH (5 mM)在PBS (pH=7.4)中37°C保存24 h稳定。在相同的条件下，炔5和四嗪6发生了不同程度的分解。

图2. AMIs的稳定性和反应性

    随后，作者研究了AMI 1与异腈2的反应动力学。反应过程动力学分析显示AMI 1浓度随时间的倒数呈线性关系，因此是二阶动力学。进一步降低pH导致非线性速率增强，从而体现了大体上的酸催化作用。作者分析了AMI -异腈连接的合理机理，首先是N ' -酰基氮的质子化，然后是异腈的加成，形成分子内捕获的腈中间体III，由此形成的恶二嗪7在第二酸催化步骤中水解以形成最终的酰胺连接产物。

图3. AMI与异腈的反应动力学和可能机理

    接下来作者利用AMIs与异腈的独特反应性结合SPAAC和iEDDA连接同时进行一锅三蛋白标记，结果表明AMI-异腈连接具有很高的化学选择性，并且与这两种最广泛应用的生物正交反应具有互补性。

图4. AMI -异腈连接在更复杂环境中的效用评估

    最后，作者通过活细胞表面标记研究了AMI -异腈连接的生物相容性。他们使用3-异氰丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS-NC 12)与氨基反应，随后加入荧光素-AMI 9并通过共聚焦显微镜分析，发现位于质膜处出现强烈绿色荧光。天然CHO细胞的对照实验几乎没有显示任何荧光，从而表明荧光素-AMI 9不会非特异性地与细胞表面结合。流式细胞术显示，标记更多NHS-NC的细胞荧光强度更高。MTT细胞活力测试显示AMI 13在200 μM浓度下无毒性。

图5. AMI -异腈连接的生物相容性

    综上， C, N-环状-N ' -酰基AMIs是与异腈生物正交连接的有效试剂，在生理pH值下，反应速率与SPAAC相当，在酸性条件下反应速率非常快(pH值为4时，k₂ ~ 100 M⁻¹ s⁻¹)。作者预计，在较低pH值下这种较高的反应性有利于选择性标记和靶向，例如，局部pH值较低的肿瘤细胞或细胞器。AMI-异腈连接反应与已建立的SPAAC和iEDDA反应正交，并且与活细胞兼容。AMI -异腈连接或将成为化学生物学、材料科学和药物发现领域的有价值的工具。

作者：ZXY  审校：WLT

DOI: 10.1021/jacs.3c07006

Link: https://doi.org/10.1021/jacs.3c07006