论文DOI：10.1002/anie.201913231
在本研究中，中山大学欧阳钢锋教授团队探讨了封装模式是如何影响酶 @MOFs 的生物功能，并提供一种新的策略可制备具有高生物活性的酶 @MOFs 材料。研究人员通用过系统的表征手段发现酶的活性转化与其封装模式密切相关，有趣的是，不同的封装模式与酶的表面电荷性质有关。研究人员通过酶表面碱性氨基酸残基的化学修饰，调节酶的表面电荷，可实现酶 @ZIF-8 封装方式的有效调控，进而改善酶 @MOFs 的生物活性。酶是一类具有生物催化功能的生物大分子，其效率、特异性和选择性远远超过人工催化剂。基于酶的生物催化在可持续合成，药物设计，生物工程以及传感等研究中异常活跃，并得到迅速发展。然而，酶固有的脆弱性质，如活性容易受到温度、pH、有机溶剂及小分子抑制剂等影响，使酶体系在实际操作中具有稳定性差和使用寿命短等问题。生物大分子的固定是指用固体材料将生物大分子束缚或限制于一定区域内，这种固定化可有效地提高生物大分子的生物活性和稳定性，有助于模拟和控制生物催化反应的进程，并具有多次重复使用和操作连续可控等一系列优点。生物大分子的固定化在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃，得到迅速发展和广泛的应用（Nat. Biotechnol. 2004, 22, 211-213; Chem. Soc. Rev., 2013, 42, 3894）。
金属有机框架（Metal-Organic Frameworks, MOFs）是一种是由有机配体和金属离子或团簇通过配位键自组装形成的具有分子内孔隙的有机-无机杂化材料。MOFs 具有比表面积高、孔径可调、组分多样、表面易功能化等诸多优点，在能源储存、催化、传感和分离等研究领域有着重要的应用前景。
除此之外，MOFs 作为载体应用于功能性生物大分子（包括酶）的固定或封装，是当下前沿的研究领域之一（Science 2012, 336, 1018-1023; Nat. Mater. 2012, 11, 1081-1085）。将酶原位封装于 MOFs 空腔（酶@MOFs）就如给脆弱的酶穿上坚实的“MOFs盔甲”，已被证实可有效提高酶的稳定性和使用寿命（Nat. Commun. 2015, 6, 7240, J. Am. Chem. Soc. 2017,139, 6530-6533）；同时，MOFs 保护层的多孔网络结构也可选择性使底物扩散进入酶的活性位点。这种共生强化效应赋予酶 @MOFs 在传感、催化和生物工程等领域巨大的应用潜力（Nat. Catal., 2018, 1, 689-695; Acc. Chem. Res.2017, 50, 1423-1432; Chem. Soc. Rev. 2017, 46, 3386-3401）。
课题组在前期的工作中发展了一种氨基酸促进的仿生封装策略，可实现不同蛋白质和酶在 MOFs 材料（ZIF-8和HKUST-1）中的高效封装（Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 1463 -1467）。但是，目前这些初步的研究主要集中于将酶包埋于具有保护作用的 MOFs 空腔，以提高酶的使用寿命及稳定性，但对酶封装前后的活性转化及影响因素仍缺乏系统研究。这一点的研究对于指导制备具有高稳定性和高活性的酶 @MOFs 材料将具有重要意义，也有望推进酶 @MOFs 在不同领域的应用进程。
我们通过一步原位封装的方式将酶封装于 ZIF-8（酶 @ZIF-8），并通过固体紫外光谱、热重分析、扫描电镜和 3D 共聚焦显微镜等手段验证 ZIF-8 封装酶的结构的成功制备（图1A-D）；并监测酶在封装于 ZIF-8 空腔后的催化动力学曲线。研究结果发现部分酶可保持较高的生物活性，但另一部分酶活性则严重下降甚至完全失活。例如， GOx@ZIF-8 可维持 90.4 % 的生物活性，但 Cyt C@ZIF-8 的活性则下降至 9.5 %（图1E 和 F）。
▲图1. 葡萄糖氧化酶 @ZIF-8（GOx@ZIF-8，A）和细胞色素 C@ZIF-8（Cyt C@ZIF-8，B）的固体紫外光谱图及扫描电镜图；FITC标记的GOx（C）和 Cyt C（D）在 ZIF-8 内的 3D 共聚焦显微镜成像图，证明酶在 ZIF-8 内均匀分布；GOx@ZIF-8（E）和 Cyt C@ZIF-8（F）的活性转化。
B. 封装模式对酶 @MOFs 活性影响及其调控方法我们接着逐一排查在封装过程中可能使酶失活的因素，包括温度、金属离子和配体等。研究发现配体 2-甲基咪唑（HmIM）在水溶液中的质子化和竞争配位作用可使酶变性（图2A 和 B）。但这仍无法解释观察到的酶活性转化规律。接着，我们通过系统的表征手段发现酶的活性转化与其封装模式有密切的联系：1）在基于酶诱导 ZIF-8 成核驱动的快速封装模式中，得到的酶 @ZIF-8 保持较高的生物活性；2）在 ZIF-8自然成核的共沉淀缓慢封装模式中（此过程中酶不参与ZIF-8成核），由于过量配体（2-甲基咪唑）的去折叠效应和竞争配位，得到的酶 @ZIF-8 趋向于失活（图2C）。
有趣的是，这两种封装模式与酶的表面电荷性质有关。我们还证实可通过酶表面氨基酸残基的化学修饰调节酶的表面电荷（图2D），并实现酶@ZIF-8封装方式的有效调控，进而改善酶 @MOFs 的生物活性（图2E和F）。
▲图2. GOx（A）和 Cyt C（B）暴露于二甲基咪唑（HmIM）溶液后的荧光光谱图；（C）基于酶诱导 ZIF-8 成核驱动的快速封装模式和ZIF-8自然成核的共沉淀缓慢封装模式的示意图；（D）通过酶表面碱性氨基酸残基的化学修饰调节酶的表面电荷示意图；通过酶表面碱性氨基酸残基的化学修饰提高 Cyt C@ZIF-8（E）和 HRP@ZIF-8（F）的生物活性。
以上研究表明可通过酶表面化学修饰调控酶@MOFs的封装模式，进而改善酶 @MOFs 的生物活性。我们接着探讨了改善后的酶@MOFs（Cyt C-A@ZIF-8和HRP-A@ZIF-8）在生物传感领域的应用。我们首先可以利用 Cyt C-A@ZIF-8和HRP-A@ZIF-8 对 H2O2 进行可视化传感。谷胱甘肽(GSH)是一种生物硫醇，与糖尿病、肝病、白内障、阿尔茨海默病和帕金森病等多种病症相关。H2O2 可氧化GSH进而影响酶 @MOFs 的 H2O2 传感性能。鉴于这一原理，我们建立了一种 GSH 的可视化酶 @MOFs 传感平台，并具有较高的检测灵敏度和较宽的线性范围。
与单酶催化相比，多酶催化级联反应是生物体内一类重要的化学转化过程，在生物信号转导和代谢途径中起着关键作用。我们可将多种酶共封装于 MOFs（简称ECMN），模拟细胞内级联催化过程；同时，可以通过调控酶的封装模式，提高 ECMN 的级联催化性能。
▲图3.（A）基于 HRP-A@ZIF-8 的 GSH 可视化检测平台示意图；（B）紫外吸收强度（650nm）与谷胱甘肽浓度的关系图；（C）GOx和 HRP 共封装的 ZIF-8 ECMN 的示意图；（D）FITC 标记的 GOx 和 RhB 标记的 HRP 共封装于 ZIF-8 的 3D 共聚焦显微镜成像图；（E）不同封装模式得到的 ECMN 的级联催化性能对比。
由于 ZIF-8 对生物大分子的高包埋效率及“盔甲”似的保护作用，近年来许多生物大分子 @ZIF-8 材料被开发并应用于生物催化、生物传感、生物制药和生物加工等领域。此外，越来越多的科研工作者致力于构建基于蛋白和基因 @nanoZIF-8 的胞内传递系统，并在肿瘤诊疗方面取得初步的研究进展。在这项研究中，我们强调封装模式对于保存生物大分子 @ZIF-8 的生物功能的重要性。重要的是，我们发现可通过酶表面氨基酸的化学修饰来调控酶 @ZIF-8 的封装模式，从而调节酶 @ZIF-8 的生物活性。这项研究为制备具有高活性和稳定性的酶 @MOFs 材料具有重要指导意义，也有望推进酶 @MOFs 材料在不同领域的应用进程。
生物大分子的 MOFs 固定化是我们课题组新涉足的研究课题。这篇文章主要探讨了酶 @ZIF-8 的活性转化及影响因素；并提出一种可改善酶 @ZIF-8 生物活性的方法。在这个工作中，我们仍有留下一些有待完善的问题。比如，尽管酶 @ZIF-8 的生物活性可通过酶表面化学修饰得到提高，但改善的酶 @ZIF-8 的生物活性仍低于游离的酶；同时，由于ZIF-8外骨骼的存在难免会影响底物的扩散，因此催化速率也会降低。因此，如何进一步提高酶 @MOFs 的催化性能仍是挑战。此外，我们也正在深入拓展酶 @MOFs 材料在纳米催化医学领域的应用，希望将来能做出更多更好的工作。
这个课题得到国家自然科学基金（21904146, 21737006, 21677182, 21527813 和 21477166）, 中国博士后创新人才项目（BX20190390），中国博士后基金面上项目（2019M653138）和高校基础研究经费（19lgpy125）等的支持，在此表示特别感谢。
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