一、文章介绍

本文作者从长柱金丝桃(Hypericum longistylum Oliv)中分离得到了3种新的具有12,13-seco-spirocyclicpolycyclic polyprenylated acylphloroglucinol (PPAP)骨架的衍生物，hyperilongenolsA–C (1–3)。随后，作者根据化合物的1D 和2D NMR数据再结合高分辨质谱确定其平面结构；根据ECD谱以及X射线单晶衍射确定其绝对构型。化合物1-3代表着首例具有一个可烯醇化β,β’-tricarbonyl 体系的12,13-seco-spirocyclicPPAPs骨架的天然产物。化合物1-3的氧甲基化，结合对其X射线衍射数据和在不同溶剂中收集的可变温度¹H NMR谱的综合分析，作者提出一个普遍的机制，在形成不可分离的C-24差向异构体的hyperilongenol A(1)，了解溶剂效应对可烯醇化β,β’-tricarbonyl烯醇质子的影响，并探索化合物1-3酮烯醇间转换的可能性。此外，作者还提出了一种合理的β-dicarbonyl和β,β’-tricarbonyl体系的结构测定方案。在活性研究中，作者发现化合物2对葡萄球菌具有较强的抗菌活性。

背景研究

烯醇化的β-dicarbonyl (β-diC)和β,β’-tricarbonyl (β,β’-triC)体系是许多天然产物中常见的结构骨架，其结构性质和功能多样性引起了科学界的广泛关注。一般来说，有机物的酮和烯醇形式在性质上是动态的，并且可能是可逆的，在互变异构化的情况下，这可以归因于质子转移。几个参数影响互变异构体间的平衡，如单对和偶极斥力、芳香共振、电负性取代基、内部氢键和互变异构体周围的溶剂。β-diC和β,β’-triC体系的稳定性可以通过共振辅助氢键(RAHB)来增强，这是一种特征的平面π电子系统，它将质子供电基团与质子受电结合起来。

天然产物 polycyclicpolyprenylated acylphloroglucinol derivatives (PPAPs)主要从金丝桃科植物中分离出，具有广泛的药理活性，如抗抑郁、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗阿尔茨海默病抗病毒活性。事实上，酮烯醇互变异构显著丰富了PPAPs的结构多样性。到目前为止，已经分离并鉴定出150多种可烯醇化的β-diC-basedacylphloroglucinol衍生物，它们具有与羰基共轭的烯醇功能。可烯醇化β-diC和β,β’-triC-containing acylphloroglucinol衍生物互变异构体通常是不稳定和不可分离的，其结构的确定具有挑战性。

  为了了解化合物1中不可分离的C-24结构形成的潜在机制，作者用TMS-CHN₂制备了O-甲基化衍生物4-13，并通过核磁共振和X射线衍射实验确定了它们的结构。采用不同溶剂中的变温¹HNMR测量方法，探讨了酮烯醇在化合物1-3中相互转化的可能性。这些新的发现使作者能够了解PPAPs中烯醇化β,β’-tricarbonylenol质子的溶剂效应。此外，作者还提出了一种合理的具有β-diC 和β,β’- triC体系PPAPs结构测定的方案。在此，作者描述了化合物1-3的分离、结构测定、假设生物合成途径及其抗菌活性的体外评价。

结果与讨论

化合物HyperilongenolA (1)是一种白色无定型粉末，尽管在高效液相色谱下观察到一个单一峰，但在氘代氯仿溶剂中得到的核磁共振信号严重重叠，因此氘代吡啶溶剂更适合于结构测定。在室温下，化合物1的¹H和¹³C-NMR谱以1：1的比例显示了两组信号。上述信息表明，化合物1是一对具有较高结构相似性的异构体(1a/1b)。作者通过高分辨质谱确定其分子式为C₂₇H₄₀O₆，不饱和度为8。在其红外光谱中，显示有羰基(1704和1665cm⁻¹)和羟基(3506cm⁻¹)基团的存在。

在氘代吡啶中记录的一组¹HNMR信号可归属为：一个烯烃质子信号 (δ_H5.40, t, 1H, J = 7.7 Hz)，七个甲基质子信号 (δ_H 0.83‒2.12, s)。通过对碳谱数据以及DEPT的分析，再结合HSQC和HMBC相关，确定化合物1中的26个碳原子，包括3个酮羰基碳信号(δ_C 206.3, 207.2, 208.9)，2个向高场移动的羰基碳信号(δ_C 197.9和198.7)，1个三取代烯烃碳信号(δ_C 120.6 和135.4)，3个sp³杂化的碳信号，包括1个氧化的季碳信号(δ_C 79.6)，2个sp³杂化的次甲基碳信号，此外，还存在7个sp³杂化亚甲基信号和7个sp³杂化甲基信号。羰基和异戊烯基团占6个不饱和度，其余的不饱和度要求1a为双环体系。通过Me-25/H-24/H₂-26/Me-27的¹H−¹H COSY相关以及Me-25与C-23的HMBC相关，表明在unit A中存在一个sec-butyl ketone基团。通过H₂-18/H-19的¹H−¹H COSY相关以及Me-21和Me-22与C-19,C-20的HMBC相关，H₂-18与C-1, C-5, C-6的HMBC相关，表明异戊烯基团的存在，并将连接在C-6位。通过Me-17, H-18 与C-1, C-5, C-6的HMBC相关，H₂-14与C-3, C-4, C-5的HMBC相关以及H₂-14,Me-15与 C-13的HMBC相关，确定了在unit B中C-3−C-6 (C-1)和C-15−C-13−C-14的连接方式（图2A）。通过H2-7/H-8/H₂-12/H2-11/H₂-10的¹H−¹H COSY相关以及Me-16与C-8, C-9, C-10的HMBC相关，表明在unit C中存在一个五元环。随后，作者H₂-7 与C-3, C-4, C-5的HMBC相关，确定units B和unit C相连。然而，由于在1D和2D核磁共振谱中缺乏C-2的有用信号，无法确定化合物1的关键信号来连接units A和units B。考虑到化合物1的分子式，两个羰基碳具有相对向高场移动的化学位移(δ_C 197.9和198.7)，这意味着在化合物1的双环结构中存在β-羟基-α,β-不饱和酮基，这可以建立units A和units B之间的连接方式。

随后，作者通过TMS-CHN₂对化合物1进行了甲基衍生化来证明其结构中存在β-hydroxyl-α,β-unsaturated ketone基团。令作者惊讶的是，所得到的四个di-O-methylated产物(4–7, Figure 3)拥有相同的分子式(C₂₉H₄₄O₆)。化合物4和5的结构是通过1D和2D NMR以及高分辨质谱确定的。通过Me-25与C-2, C-23,  C-24的HMBC相关以及OMe-1/C-1，OMe-23/C-23的HMBC相关，确定这两个甲氧基连接在C-1和C-23位，并且确定了C-2 与C-1, C-3, C-23的连接。因此，甲基化衍生物4和5为1的双甲基化衍生物，表明在C-1-C-3片段中存在一个β-羟基-α,β-不饱和酮基，并在化合物1的侧链中的酮烯醇互变异构(图2C)。基于上述证据，化合物1a/1b可能是一对C-24位的差向异构体，它们的平面结构(如图2c所示)具有独特的12,13-seco-spirocyclic PPAP。以与化合物4和5的结构相同的方式，6和7的结构也被确定为如图所示（图3）。在化合物6和7中，根据OMe-3/C-3，OMe-23/C-23的HMBC相关，确定两个甲氧基连接在C-3和C-23位，而不是化合物4和5中C-1和C-23位。化合物1的每个甲基化衍生物（4-7）由C-2-C-23键周围的受阻旋转形成一对atropisomers。

Figure 3. Methylation ofcompounds 1‒3.

通过H-8 与H-14β, Me-15, Me-16的NOESY相关，确定化合物1中unit B和unit C的Me-16和H-8的相对构型为β构型。然而，化合物1的C-4、C-6和C-24位手性中心的立体构型和烯醇质子的位置尚不清楚。化合物1中四种二甲基化产物的存在，表明它可能有四种不同的烯醇互变异构体(1a-1d，图4)。根据以上化学衍生化证据和详尽的文献研究，作者推测由于酮烯醇互变异构，在C-23和C-24处的C=C双键之间可以通过顺式−反式异构化来实现互变异构体1a/1b或1c/1d的相换。此外，互变异构体1a/1c或1b/1d也可以通过碳的质子转移相互转化。

Figure 4. Listedpossible stereoisomers for each tautomer (1a, 1b, 1c or 1d) and mutualtransformation.

为了证实四种不同异构体(1a-1d)的共存，用变温核磁共振波谱对化合物1进行了进一步的分析。作者在氘代吡啶中，从343K到280K获得了¹HNMR(800MHz)谱，其中Me-15(δ_H 2.08-2.13)的峰比较密集，可分辨的质子信号较少，H-24质子信号的峰较宽(δ_H3.84,m;3.93,m)和另一个烯基质子的逐渐出现。在这种情况下，很难在氘代吡啶中清楚地区分四种不同异构体。然而，在氘代氯仿中，当从温度313k到280k时，得到的¹HNMR(800MHz)谱数据显示，Me-15 (δ_H2.12-2.17)出现两个宽单峰质子信号倾向于分裂成四个可区分的单峰甲基信号。在变温核磁共振测量中，观察到四组核磁共振信号的共现，进一步证实了上述结论。基于化合物1a-1d的结构，烯醇质子倾向于通过与羰基的氧原子参与强的分子内氢键来形成稳定结构，从而导致羟基质子在¹HNMR谱中的化学位移急剧向低场移动。随后，在不同氘化溶剂(包括氘代吡啶和氘代氯仿)中，在0~20ppm区域测量了化合物1(600MHz)的¹HNMR谱。值得注意的是，在氘代氯仿的16~20ppm区域，观察到四个明显的向低场移动的羟基质子信号并且分辨率较高，表明四个互变异构体(1a−1d)在化合物1中共存。

Figure 5. (A) ¹HNMR (800 MHz) spectra of 1 in C₅D₅N at differenttemperatures; (B) ¹H NMR (800 MHz) spectra of 1 in CDCl₃at different temperatures; (C) Enol proton in ¹H NMR (600 MHz)spectra of 1 in CDCl₃ at 313 K and 298 K

X射线晶体学是研究酮烯醇互变异构的一种有用方法，因为它可以提供关于原子的空间分布和构象的有价值的信息。经过多次尝试，从MeOH–Me₂CO–H₂O(75:15:10)中得到了化合物1的合适晶体，并且用CuKα辐射对其进行了单晶X射线衍射分析[CCDC 1873487,Flack parameter –0.16(9)]。如图所示。通过对C(1)–O(1)键长(1.282 Å)的分析，证明了化合物1晶体结构中可烯醇化β,β’-tricarbonyl体系，其长度大于C(3)–O(3) (1.209 Å),C(13)–O(13) (1.208 Å) and C(23)–O(23) (1.253 Å)[CCDC 1873487]。虽然质子间转移反应是动态的，但晶体结构代表了该过程的平均和“冻结”平衡状态。因此，X射线衍射实验表明，化合物1应该是一对C-24差向异构体(1a/1b)，它们的绝对构型被明确定义为4S, 6R,8R, 9R。事实上，上述证据表明，化合物1在溶液中应该是不可分离的构型异构体的混合物(1a-1d，图5)，在固体晶体中应该是一对不可分离的C-24差向异构体(1a/1b)，并且化合物1具有新的12,13-seco-spirocyclicPPAP核结构。

Figure 6. ORTEP plotsfor the molecular structure of 1 drawn with 50% probability displacementellipsoids

化合物2和3为黄色粉末，通过高分辨质谱分别确定其分子式为C₂₇H₄₁O₆和C₂₆H₃₈O₆。对化合物2和3的1D和2D NMR数据与化合物1的数据进行了详细的比较（表1），发现它们具有较高的结构相似性，但在C-2位的取代方式不同。化合物1中的2-甲基丁基酰基，在化合物2中替换成了3-甲基丁基酰基，在化合物3中替换成了丙酰基，这些结构可以在¹H−¹H COSY和HMBC相关中得到证实。随后，制备了4种化合物2的二甲基化衍生物（8-11)和2种化合物3的二甲基化衍生物(12-13)(图3），并以与介绍化合物4-7相同的方式，根据它们的高分辨质谱和NMR谱确定了它们的结构。每个衍生物（8-13）也被确定为一对atropisomers，其方式与4-7相同。虽然由于样品的限制，化合物8-11的一些光谱数据无法清楚地分配，但令作者高兴的是，从MeOH-H₂O（95：5）中得到了产物9的单晶，其绝对构型由单晶体X射线衍射用CuKα辐射[CCDC 1873489,

Flackparameter 0.06(3)]，确定为4R,6S, 8R, 9R。因为化合物2和3与化合物1有相同的可烯醇化 β,β’-triC基团，在氘代吡啶和氘代氯仿溶剂中，在313K和298K下获得了化合物2和3的¹HNMR谱(600MHz)。在氘代氯仿光谱中还观察到了向低场移动的C-1和C-3的两个烯醇质子，这表明化合物2和3分别具有两种不同的烯醇互变异构体。随后，将化合物2和3的实验ECD曲线与化合物1的曲线(图S21)进行了比较，并对衍生物9进行了X射线衍射分析，从而确定了化合物2的绝对构型为4S, 6R,8R, 9R。在本研究中，获得了化合物3的一个合适的晶体，并随后使用CuKα 辐射进行了晶体学分析 [CCDC 1873488,Flack parameter, 0.02(4)]，确定其绝对构型为4S,6R, 8R, 9R。

Figure 7. ORTEP drawingof compounds 3 and 9.

 在本研究中，十种轴手性bi-O-methylated衍生物（4-13）的共同特点表明，在烯醇互变异构化过程中，由于C-2-C-23键周围的旋转，可以形成1-3的多种构象。随着取代基长度的增加，π键体系(C₁=C₂-C₂₃=C₂₄)的刚性将减小。也就是说，与化合物3相比，化合物1和2在C-23侧链中具有较大的取代基，π键系统的刚性较小，其灵活性也得到了提高，从而造成了NMR结构的构象变异性。Michinori Ōki指出动态核磁共振波谱可以应用于有机化学。与核磁共振时间量程相比，有机化合物的不同构象可以经历缓慢的翻转，这可能导致立即或严重的展宽和最初尖锐的碳信号。因此，作者观察到，在3中C-2的NMR信号变宽并变得不那么强烈，而在1和2中C-2的NMR信号重叠，这是因为它们在侧链中分别具有较大的sec-butyl基团和甲基丁酰基基团。

烯醇互变异构体在可烯醇化多环酰基间苯三酚衍生物中的共存通常可以忽略。在研究中，作者在氘代吡啶中获得的¹HNMR谱中没有观察到烯醇质子信号。然而，在DMSO-d₆中获得的¹HNMR谱中观察到的羟基质子信号变得更宽，峰强降低。许多研究报道，溶剂对酮烯醇互变异构有很大的影响，包括氢键相互作用和吡啶和二甲基亚砜的碰撞诱导复合物形成。有趣的是，作者可以在化合物1的¹HNMR谱中观察到四组烯醇质子，在化合物2和3的光谱中有两组烯醇质子，这意味着化合物1-3都包含烯醇互变异构体。在本研究中，作者发现负责酮烯醇互变异构的直接质子转移对NMR谱的影响很小。具有可烯醇化的β-diC 和β,β’-triC体系的有机物质的结构测定是非常具有挑战性的。据作者所知，几乎有100个多环间苯三酚衍生物具有可烯醇化的β-diC或β,β’-triC核已经被报道，且没有确凿的证据。虽然X射线衍射分析被公认为是有机化合物结构表征的一种强有力的方法，但以这些具有β-diC 和β,β’-triC体系衍生物为例，强烈建议以氘代氯仿为溶剂，在0-20ppm区域记录它们的¹HNMR谱，这将有助于这些化合物中酮烯醇互变异构的结构研究。

化合物1-3可能的生合成途径

HyperilongenolsA–C (1–3)是首例具有一个12,13-seco-spirocyclic骨架的PPAPs的天然产物。作者提出了一种用于形成化合物1−3的假设生物合成途径。中间体I可以通过酶催化，加入异戊二烯基或香叶基焦磷酸酯生成间苯三酚核；然后，通过一系列化学反应，包括分子内环化、环氧化和环化，从中间体I中产生中间体II；随后，中间体III可以通过电子传递和裂解产生。化合物1−3最终是中间体III的还原生成。

Scheme 1. Possiblebiosynthesis pathway of 12,13-seco-spirocyclic scaffold.