光动力疗法(PDT)使用合成光敏剂(PS)在光照下产生活性氧(ROS)诱导细胞死亡。PDT由于其愈合过程快和缺乏耐药性，与传统的癌症治疗相比具有显著的优势。由于这些染料大多数用单光子(OP)和线性激发，ROS不可避免地对周围的健康组织造成损伤。另一个主要问题是光敏剂在光化学途径中的缺氧敏感性。肿瘤缺氧环境和¹O₂的短寿命降低了治疗效果，导致在应用时需要加入较高的光敏剂浓度或延长光照时间。双光子激发(TPE)是PDT的一种替代工具，它利用近红外(IR)区域的低能量入射光(700-950 nm)进入较深层的组织，健康组织受光损伤小。此外，TP-PDT拥有更好的空间精度。因此，此种方案的ROS产生可以控制在与激光束焦平面相对应的可控区域，实现对组织内的目标病理部位进行治疗而不损害周围的健康组织。

近年来，偶氮染料的高生物相容性被广泛用作开发荧光成像系统，应用于检测各种生物分析物和酶。偶氮染料的非辐射衰变可归因于单线态到基态的快速内转换，然而人们对它的荧光淬灭过程知之甚少。偶氮结构在光敏剂中被用作失活单位，当偶氮结构被消除时，光敏剂可以恢复产生¹O₂生成能力。此外，花菁染料通常用作显像剂，但由于长链的光不稳定性限制了它们的发展。因此，作者推测偶氮基团与花菁染料的结合可以作为一种PDT光敏剂，对花菁染料进行改性以提高其光稳定性。

近日，亚洲大学Hwan Myung Kim教授课题组在《Chem Sci》上以“An azo dye for photodynamic therapy that is activated selectively by two-photon excitation”为题发表了一篇研究论文。在本文中，作者报道了一个偶氮基菁类衍生物(ACC1和ACC2)作为双光子激活的I型光敏剂。这些小分子有机染料在生理条件下显示出明显的ROS生成能力，以及快速进入细胞的能力和低毒性。用单光子和双光子显微镜对活细胞的分析显示，这些染料在双光子激发时比在单光子激发时表现出更高的ROS生成能力。并且与传统分子相比，在温和条件下具有优异的PDT性能。

分子内的旋转可以阻碍激发态的不稳定性，如光异构化，因此染料的设计关键是半花菁的构象刚性 (NCC1)。此外，NCC1包含一个电子推拉系统，通过线性共轭结构连接胺和吲哚位点。二甲基苯胺与NCC1偶联生成含偶氮桥的染料(ACC1)，该染料控制染料的光电性质。ACC2在偶氮结构的邻位上有一个甲氧基，这使它比ACC1更富电子。染料的合成路线如图所示。关键中间体1由4-硝基水杨醛与N -烷基化吲哚啉缩合而成。接下来，以NCC1的重氮盐和N,N-二甲基苯胺衍生物为原料，经1 H-NMR, 13C-NMR和ESI表征，制备了ACC1和ACC2。

在PBS缓冲液(pH 7.4)中，NCC1的最大吸收为532 nm，最大荧光发射为570 nm，荧光量子产率为60%。ACC1和ACC2的吸收波长则分别为565 nm和586 nm。ACC2分子的摩尔消光系数达到2.7×10⁴ M^-1 cm^-1，高于NCC1(1.8×10⁴M^-1 cm^-1)和ACC1(1.6×10⁴ M^-1 cm^-1)。这些光谱红移可能是由于共轭长度的延长和分子内电荷转移特性的增强所引起。相比之下，ACC1和ACC2的荧光和磷光发射可以忽略不计。用荧光法测定NCC1的双光子吸收截面为103 GM，而ACC1和ACC2的值由于发射强度较弱，无法测定。单光子和双光子过程中这种显著的荧光猝灭可以归因于系间窜跃或热弛豫，基于这一现象，作者决定评估ACC1和ACC2的ROS产生效率。

作者在一般荧光性激活ROS分子DHR 123的存在下，评估了PBS缓冲液中ACC1和ACC2产生ROS的能力。使用荧光分光光度计进行单光子照射30分钟后，DHR 123的发射信号略有增加。100 mW功率下770 nm双光子照射30分钟后，在ACC1溶液中观察到526 nm的强发射(如图a)，这是由于ROS使DHR 123氧化所致。ACC2的效率大约是ACC1的4倍。在相同的双光子照射条件下，在含有抗氧化剂维生素C (100 μM)时，氧化DHR 123在526 nm处的荧光明显受到抑制。染料NCC1在DHR 123中没有显示光谱变化，这表明偶氮结构可能在双光子激发的ROS生成中发挥关键作用。作者又在相似的单光子和双光子条件下，使用ABDA分子测试¹O₂的生成效率。在单光子和双光子照射下，ABDA的光谱无明显变化(图b)，说明ACC1和ACC2主要通过I型光化学反应产生ROS。如图c，在750-900 nm范围内不同波长的双光子(100 mW功率下30分钟)测试表明，770 nm是产生ROS的最佳激发源，且ACC2比ACC1更有效。为了阐明双光子/单光子产生ROS是否取决于入射光的功率，作者比较了相同辐照功率下单光子 (λ_max)和双光子 (770 nm)的照射结果(图d)。结果表明，与单光子相比，ACC1和ACC2染料在双光子照射时产生的ROS数量明显更多。

作者又在活细胞中测试了ACC1和ACC2的ROS生成能力。在单光子/双光子照射下，细胞产生了ROS，这一现象被DHR 123分子荧光恢复所确认。在PBS缓冲液中观察到，在细胞中，ACC2染料比ACC1产生更多的ROS。然而，当单光子照射是维持在488 nm(或552 nm)，没有明显的ROS产生(图 a和b)。如图c，为了证明双光子照射ACC1和ACC2孵育的细胞会导致细胞凋亡，作者使用碘化丙啶(PI)进行PDT分析，PI是一种经典红色荧光核染料，用于检测群体中的死亡细胞。对HeLa细胞进行靶标区域双光子照射，随着DHR 123荧光强度的增加，仅在靶区出现明显的PI核聚集，且有强烈的红色荧光。

作者为了阐明通过ROS自由基驱动(I型)或单线态氧生成(II型)的细胞内TP-PDT机理，进行了ROS清除剂存在下的细胞实验。如图所示，分别使用ACC1和ACC2与HeLa细胞孵育，双光子照射和随后的PI染色表明，大部分细胞发生了凋亡。此外，细胞在单线态氧清除剂NaN3的存在下发生凋亡，在维生素C存在下，未观察到细胞凋亡。这些结果表明，双光子照射下的细胞凋亡通过I型PDT过程发生。

作者随后测量了不同激发功率下的死细胞比率。PDT效率通过PI染色法和Hoechst 33342分别计数死细胞和活细胞来确定。孵育ACC2的细胞在770 nm光照射下，PI染色的细胞数量增加，而未照射区域显示的是Hoechst染色的细胞，表明细胞凋亡是双光子光源照射的结果(图a)。为了模拟缺氧状态组织深处的固体肿瘤，作者用HeLa细胞在缺氧条件下(5%CO₂、2% O₂)培养4 h和相同条件下1 μM的ACC2孵育HeLa细胞1 h。HeLa细胞被保持在缺氧条件下培养，对其进行PDT和死细胞比率的研究。与常氧条件相比，1 μmM的ACC2在低氧条件下保持较好的PDT效应和PDT效率。此外，通过表征Log(LD₅₀)和Log(laser power^-1)之间的线性关系，证明两种探针都经历了非线性的PDT过程(图d)。这些结果表明，ACC2和ACC1都是有效的双光子I型光敏剂。

为了研究分子的PDT效率，作者用双光子光敏剂与已知FDA批准的5-ALA和Visudyne进行了比较。由于5-ALA转化为光敏原卟啉IX (PpIX)涉及血红素的生物合成，因此将HeLa细胞与1mm 5-ALA孵育24小时以提高PpIX的产量。如图所示，5-ALA和Visudyne在高浓度处理和长时间孵育的情况下，均未表现出药物的毒性。与Visudyne相比，ACC2和ACC1的细胞凋亡浓度(1 μm)低了10倍，这一结果说明ACC2和ACC1是有效的光敏剂。

光敏剂在二维细胞培养TP-PDT中获得的良好结果，这促使作者进一步研究其PDT模拟多细胞肿瘤球 (MCTSs)的效率。为了证明光敏剂在微癌治疗中的能力，作者制备了2400 μm的MCTSs，并与ACC2孵育30分钟。目标区域直径40 ±5 μm，770 nm光源 (100 fs， 80 MHz， 1.6 mW)。三维图像显示了在激光束的焦平面上产生了精确的ROS。因此，ACC2能够在模拟肿瘤球内的特定区域进行PDT，而不会损伤非靶标区。

综上所述，作者开发了双光子激发的I型光敏偶氮菁染料(ACC1和ACC2)。这些小分子在生理条件下表现出显著的ROS生成效率，进细胞快，且毒性可以忽略不计。单/双光子显微镜实验及抑制研究表明，光敏剂通过双光子激发和I型过程选择性地产生ROS。与传统分子Visudyne和5-ALA相比，这些光敏剂在较低的负载浓度、孵育时间和双光子激发功率下具有更好的PDT性能。这些特征使得只有在模拟肿瘤球状体的靶标区域才能进行精确的PDT，不损伤其他区域。该双光子光敏分子将有助于有效的PDT应用和设计各种光敏剂。

DOI: 10.1039/d0sc05686c

Hwan Myung Kim

亚洲大学能源系统研究系、化学系教授，课题组主要研究领域：

i） 生物成像探头和；ii） 非线性光学材料。

i）实验室使用分子设计、有机合成和生物成像方法，创造新的化学方法，如小分子荧光探针和生物成像工具，用于研究人类疾病的基本方面和早期诊断。

ii）追求各种非线性光学和双光子吸收材料，用于光电子学和多光子显微镜的可能应用。

http://ws.ajou.ac.kr/~ompl

编辑  路栩

审核  杨思慧

推送  赵晓蕊