荧光成像方法是检测和跟踪细胞或细胞器的重要工具，在分辨率和特异性方面具有挑战性。在分子水平上利用时空控制的荧光成像技术检测细胞的活性是化学生物学中很有前途的应用之一。三磷酸腺苷 (ATP)、二氧化硫、一氧化氮和甲醛释放等方面的成像已经取得了重大进展。可远程激活荧光团具有多种优势，特别是在可控性、空间选择性和非侵入性方面。一般来说，需要对具有感光基的荧光团进行复杂的修饰。由于具有良好的光稳定性和光谱可调性，且与近红外(NIR)吸收和发射兼容，花菁染料被广泛应用在细胞成像中。

近日，南京大学化学与化工学院高分子科学与工程系冯福德教授团队和中国科学院化学研究所北京分子科学国家实验室有机固体重点实验室王树教授团队在《Angew. Chem. Int. Ed.》发表了一篇题为“Photoactivated in situ Generation of Near Infrared Cyanines for Spatiotemporally Controlled Fluorescence Imaging in Living Cells”的研究论文。这种新方法有望在细胞研究中应用于活细胞的原位时空控制荧光成像。该团队开发了一种在温和条件下一锅法合成Cy5的新方法，与有机溶剂系统相比，37 ℃的亚细胞环境（即溶酶体）有利于Cy5的光驱动形成，因此，利用原位生成的Cy5荧光团可以对活细胞进行时空控制成像。

图1 (a) 通过光激活1-(3-氨基丙基)-2,3 -三甲基- 3H -吲哚(TMI)三聚合成Th-Cy5。 (b) 反应溶液随时间的UV-vis吸收光谱。(c) CDCl₃中Th-Cy5的¹H NMR谱。(d) TMI (3.6 μM)和Th-Cy5 (3.6 μM)在甲醇中633 nm激发下的荧光光谱，激发波长为633 nm。

图2 (a) 在无水乙醇中，不同时间内光解TMI与DMPO自旋加合物ESR谱，g因子为2.001107。为了检测由TMI产生的自由基中间体，作者使用5,5-二甲基-1-吡咯-1-氧化物(DMPO)作为自旋捕获剂。在没有光照的情况下，即使在加热条件下，在3320-3390 G区域也只显示出噪声信号。(b) CD₃OD中DMPO、TMI和分离的TMI-DMPO加合物(来自与作为溶剂的乙醇反应)的¹H NMR谱。(c) TMI-DMPO加合物HRMS分析。(d) 在光照下形成 TMI-DMPO• 的合理机制。作者推断TMI自由基被DMPO光生并捕获形成加合物，该加合物可通过¹H NMR(图2b)和HRMS(图2c)分析验证。

图3 光激活生成Cy5的机制。整个过程被简化为三聚反应，以TMI衍生物为单体。

图4 (a) 在溶酶体中原位生成Am-Cy5。(b) 经TMI处理的HeLa细胞在白光LED照射或不照射下的CLSM图像。比例尺为10 μm。(c) TMI处理后HeLa细胞在不同温度或培养基的条件下的CLSM图像。比例尺为20 μm。从图像中可以看出对于低温下LED光孵育或照射的细胞Cy5的形成被阻断，血清成分促进TMI的摄取，因为与提供血清的阳性对照相比，在无血清培养基中Cy5荧光信号微弱。(d) 不同抑制剂的作用。HeLa细胞在含450 mM蔗糖、5 mM β环糊精、40 μM诺可达唑、50 mM NH₄Cl或0.01% w/v NaN₃的培养基中孵育2 h后与TMI孵育。在光照30 min后测量红色通道的荧光强度。对照组(100%)：无抑制剂。

图5 (a) 白光LED照射30 min后，TMI处理后的HeLa细胞CLSM图像。比例尺为10 μm。蓝色通道：ex = 405 nm, em = 415-450 nm；绿色通道：ex = 488 nm，em = 500-600 nm；红色通道：ex = 633 nm, em = 650-750 nm。 (b) HeLa细胞3D (z堆叠)CLSM图像。比例尺为10 μm。(c) BSA-Cy5 处理后细胞的荧光强度与 BSA-Cy5 浓度的函数关系图。(d) TMI处理后 (0.1 mM，左)和BSA-Cy5 处理后(0.8 μM，右)HeLa细胞的CLSM图像。通过图像可以得出，BSA-Cy5通过内吞作用被内化，与血清蛋白复合物TMI相似。

综上所述，该团队开发了一种通过白光LED光激活TMI合成Cy5荧光团的新方法，并提出了一种自由基参与的三聚反应机制来解释N-烷基侧链形成共轭骨架的机理。在活细胞中摄取TMI可以在溶酶体区室中选择性地形成Cy5，除了可见光，不需要任何外源性的介质，为实现对活细胞的时空成像提供了新思路。

王树，中国科学院化学所，研究员。2004年10月至今任中国科学院化学研究所研究员，博士生导师。目前担任副所长、有机固体院重点实验室副主任、北京分子科学国家研究中心办公室主任。2007年度获得“国家杰出青年基金”；入选2013年度科技部中青年科技创新领军人才；荣获2014年度化学研究所化学科学奖教金（创新奖)、2014年北京市科学技术一等奖；2015年入选国家百千万人才工程；2016年入选国家"万人计划"领军人才；2017年入选 Fellow of the Royal Society of Chemistry。

研究领域：

导电高分子与生物活性分子的特异性识别有机结合：

1、设计新型的生物活性导电高分子材料；

2、研究它们的生物识别与传感的机理；

3、发展用于检测生物大分子与重要生命化学反应的新型高灵敏度与高选择性生物传感体系；

4、发展用于疾病早期诊断和治疗的新技术。

作者主页：

http://159.226.64.165/web/19357/home

冯福德，南京大学化学化工学院教授，博士生导师。2009年毕业于中国科学院化学研究所，获理学博士学位。2009年至2013年，分别于美国佛罗里达大学和贝勒医学院从事博士后研究工作。2013年入选中组部青年计划。

研究领域：

1）光功能高分子材料；2）医用高分子材料；3）生物传感与成像；4）核酸输送和药物输送。

作者主页：

https://chem.nju.edu.cn/ffd/list.htm

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/anie.202103706

DOI：10.1002/anie.202103706

编辑：王珂

审核：贺芳

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