DNA编码文库（DEL）被广泛用于小分子药物的分析，并且在过去的20年中，它们的应用得到了进一步的发展。传统的DEL筛选需要高度纯化的目标活性蛋白（POI），因此，它不适用于某些重要的不能重组表达并以完全活性的形式纯化的药物靶标类。此外，传统的DEL筛选是在POI的稀溶液中进行的，该溶液主要包含水，缓冲液和盐，而细胞胞质溶胶含有20％至30％（重量）的多种多样的大分子，因此稀溶液不能如实地复制细胞环境。这种非生理性的筛选环境不适用于某些重要的药物靶标类别。因此，一个具有高生理相关性且不需要纯化活性POI的筛选系统非常重要的。

近期，丹麦 Vipergen ApS 公司的首席执行官Nils Jakob Vest Hansen作为通讯作者在《Journal of the American Chemical Society》上发表了题为“ Screening of DNA-Encoded Small Molecule Libraries inside a Living Cell “的文章，这篇文章首次成功筛选了一个活细胞内具有数百万个成员的DEL。文章展示了一种利用来自南非爪蛙卵母细胞的新方法。卵母细胞的体积大小为1 μL，比正常体细胞大10万倍，因此可以直接简单地注射DEL，解决了在体内跨细胞膜递送DEL的难题。通过细胞结合剂捕集富集（cBTE）的方法，靶蛋白与“猎物”蛋白在卵母细胞中融合表达，以进行特定的DNA标记，从而区分与靶蛋白结合的DEL成员与内源性细胞蛋白。文中针对p38α、ACSS2和DOCK5这3个与药物相关的蛋白靶点，筛选了1.94亿的DEL成员，从而确定了多个化学簇。对于p38α，获得了单位纳米摩尔电位的有效命中。这项工作证明了一种强大的DEL筛选新方法，该方法不需要高度纯化的活性靶蛋白，并且可以在生理相关条件下进行筛选，从而增加DEL可调节目标空间，降低损耗率。

图文解读

图1.在活着的非洲爪蟾卵母细胞中进行DEL筛选的细胞结合剂捕集富集（cBTE）。构建POI与“猎物”蛋白融合表达的cDNA质粒，通过体外转录获得mRNA，从而可注入卵母细胞中进行表达。将DEL和“诱饵”（即与 “猎物”蛋白具有高度特异性结合亲和力的小分子）拴系在短双链DNA（诱饵DNA）上，并注入表达有POI-“猎物”蛋白得到卵母细胞中。文库成员与POI的结合以及猎物与诱饵的结合都发生在卵母细胞内部。然后通过离心破坏卵母细胞的膜，将上清液转移到新的试管中，并进行结合剂捕集富集（BTE）。

图2.（A）POI-“猎物”蛋白概念构建及其大小。p38α和ACSS2构建体包含全长蛋白质，而DOCK5构建体仅包含Dock同源区域2。猎物蛋白是人碳酸酐酶IX的催化域（28.1 kDa）。（B）诱饵DNA的表示图和诱饵分子的结构。为了形成诱饵DNA，通过接头将诱饵安装在58 / 60-mer双链体DNA上，以保护其在卵母细胞中免受硫代磷酸酯作用降解。并且诱饵-DNA具有粘性末端，可确保与文库DNA定向连接。

图3.（A）成对的Tanimoto相似系数（Tc）的热图，不同颜色代表不同靶点的特异性命中：绿色，p38α；橙色，ACSS2；紫色，DOCK5；棕色，非POI。（B）p38α的热图部分标注了IC₅₀值（绿色，低于10 μM；橙色，10–200 μM；灰色，> 200 μM）和化学结构（星号表示原始DNA附着点）。在ADP探索性酶活试验中验证了观察到的p38α靶点的特异性命中，并使用IC₅₀值注释了热图。

图4.（A）对p38α，ACSS2和DOCK5观察到的命中数的维恩图。注入的诱饵DNA量对信号强度的影响很小，而注入较少的诱饵DNA往往可以提供混杂的命中次数更少（非POI）的数据。三种诱饵DNA浓度的维恩图表明，对于给定的靶标，在三个实验中均观察到30–50％的命中。该结果表明良好的再现性和鲁棒性。（B）实验1与实验2的命中次数观察图。p38α特异性命中为绿色，非POI命中为棕色。将250和100 fmoles诱饵DNA观察到的p38α命中进行比较（实验1和2），正如预期的那样，观察到的次数较多的命中是一致的，而观察到的次数较少的命中则有所不同。

总结展望

文章建立的方法可以在活细胞中（即在生理相关条件下）进行DEL筛选，无需高度纯化的活性靶蛋白。因此，该方法提供了扩大和补充DEL的目标空间的机会，同时减少了由于在早期方法中使用的高度人工筛选条件下蛋白质折叠不当导致的筛选伪影。该方法非常适合在数百甚至数千个靶标的大规模筛选中使用，因为输入的是靶标基因，消除了对纯化活性蛋白的需要。作者通过使用源自转基因青蛙的卵母细胞或通过共注射影响这些修饰的蛋白质的mRNA来进一步开发该策略，以允许筛选多亚基蛋白质复合物，甚至进行翻译后修饰。此外，此方法可能用于鉴定天然存在于卵母细胞中或辅以共表达的依赖于辅因子和结合伴侣的配体。作者希望像BTE中一样，通过具有不同的猎物/诱饵对，可以在cBTE中实现多路复用。多路复用方法将有助于特异性评估，并能够降低成本和提高通量。

https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jacs.0c09213

DOI：10.1021/jacs.0c09213