今天给大家分享一篇近期发表在J. Am. Chem. Soc.上的研究，题为：Polymer-Based Bioorthogonal Nanocatalysts for the Treatment of Bacterial Biofilms。文章的通讯作者是University of Massachusetts Amherst的Vincent M. Rotello教授。

“利用生物正交催化手段原位激活药物活性”是一种在医学领域经常用到的策略,旨在增强治疗的靶向性，降低脱靶效应。在这一类催化剂中，过渡金属催化剂（transition metal catalysts, TMCs）被广泛采用。TMCs可以在靶点处脱去原药（prodrug）的保护基团，并使其恢复药物活性，实现靶点处的原位治疗。但是TMCs较差的水溶性和不理想的生物相容性限制了其在生物环境中的直接应用。为解决这一问题，其中一种有效的方法是将TMCs引入纳米材料以增加疏水性催化剂的溶解性和稳定性，同时使催化剂在复杂的生理环境中仍旧保持催化活性。这一策略可以应用于针对细菌生物膜（bacterial biofilms）、组织和细胞环境等的治疗中。

细菌生物膜是指细菌粘附于接触表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物。这种膜基质能很好地保护细菌，并阻碍大多数疏水性分子（包括抗菌药物）的渗透，给抗菌处理造成了挺大的麻烦。

在这里作者报道了一种自组装聚合物纳米粒子，他将TMCs包裹在疏水口袋中，提供了一种生物正交的聚合酶（polyzyme）。聚合酶的合成与设计需要考虑两部分：一是自组装的纳米聚合物，二是被封装的金属催化剂。聚合物单体有两个要求：一是要有烷基侧链，促进自组装并提供疏水性内壳，用来保护TMC；二是含阳离子末端基，以保持水溶性和穿透生物膜的能力。作者合成了含C11碳链和季铵盐阳离子侧链的聚合物，催化剂方面选择了[Fe(TPP)]Cl，因为他的催化效率很高（图1a）。在存在生物硫醇的情况下，这种铁配合物催化剂能催化芳基叠氮化合物还原成对应的胺（图2a），在此催化循环中以谷胱甘肽（GSH）为硫醇还原剂。聚合酶的动态光散射（DLS，图1b）测量显示，自组装和封装后形成了50 nm的纳米催化剂，没有观察到聚集。通过透射电子显微镜（TEM）证实了粒子的结构（图1b），黑点代表的[Fe(TPP)]Cl聚集在纳米粒子当中。

图1. 聚合酶的a)组成和b)结构测定

紧接着作者测定了溶液中的催化效率，通过激活Pro-Res（试卤灵分子前体）来量化酶的活性，Pro-Res被芳基叠氮碳酸酯封端无法产生荧光，在催化剂作用下发生裂解释放出试卤灵分子产生荧光（图2a），为催化动力学研究提供了直接途径。如图2b所示，将底物和聚合酶混合后荧光立即增强，而Pro-Res对照组没有明显变化，聚合酶活性遵循米氏方程的动力学模型（图2c），催化过程能过进行简单的量化。

图2. 借助荧光的聚合酶动力学研究

在表征了聚合酶在溶液中的催化活性后，作者进一步探讨了生物膜环境中的催化。由于催化剂在生物膜内的富集能力是原位活化的关键，因此利用共聚焦显微镜测定了聚合酶的穿透能力。为了便于检测，作者用无金属的红色荧光TPP替代了非荧光的[Fe(TPP)]Cl。为了方便显微镜观察，作者选择表达GFP的大肠杆菌生物膜，并用结晶紫染色确认了生物膜的形成。实验表明，被封装的TPP能很好的渗透生物膜，而游离的TPP却不行（图3），表明聚合物基纳米支架可以作为载体促进疏水性的TMCs渗透到生物膜中。

图3. 聚合酶的TPP类似物在生物膜环境中的富集和催化研究

接下来作者用聚合酶进行了原药的激活实验，选用了两种氟喹诺酮类药物，莫西沙星和环丙沙星作为抗菌药物，因为他们具有广谱活性。这些药物通过氮上的官能团修饰转化为原药，因为这个位点的修饰阻碍了药物与DNA旋转酶和拓扑异构酶IV的结合，通过修饰有效的降低了他们的抗菌活性。作者使用了莫西沙星原药来治疗尿道致病性大肠埃希菌（E. coli – CD – 2），用环丙沙星原药治疗绿脓杆菌（ATCC-27853）。在这些实验中，仅用原药处理的生物膜和原药与聚合物处理的生物膜作为两个阴性对照，直接用药物处理的为其阳性对照。孵育6小时后，用alamar Blue测定生物膜活力。图4c和4d显示了实验结果，如预期的那样，在聚合酶存在下，用原药处理的生物膜表现出明显下降的生存力，其效果与直接使用药物的阳性对照组完全相同，而阴性对照组原药的毒性几乎可以忽略不计。同样，原药与聚合物的结合也没有表现出对生物膜的毒性，说明原药的活化是由聚合物中负载的催化剂介导，而不是聚合物本身。

图4. 聚合酶介导的药物释放的抗菌活性研究

最后作者进行了细胞毒性实验，选择成纤维细胞进行研究，因为它们在伤口愈合的过程中非常重要。作者研究了聚合酶对哺乳动物NIH 3T3（ATCC CRL-1658）成纤维细胞的细胞毒性，用聚合酶培养成纤维细胞，用alamar Blue测定细胞活力。如图5所示，用于生物膜处理的任何浓度的聚合酶都没有观察到急性细胞毒性。这一结果表明，聚合酶在消除致病性生物膜的伤口治疗上很强的竞争力。

图5. 聚合酶的细胞毒性实验

总的来说，作者为生物正交过渡金属催化剂在复杂生物环境中的应用提供了新平台。该聚合酶由自组装的疏水侧链功能化的聚合物纳米粒子包覆TMCs而成，将TMCs加载到聚合物纳米粒子中提高了其水溶性和稳定性。抗菌研究证明了这些聚合酶的治疗应用潜力，具有阳离子功能化的表面为聚合酶提供了穿透细菌生物膜的能力。值得注意的是，在不影响成纤维细胞活力的浓度下，多聚酶对药物前体的活化表现出很好的催化效率，并在生物膜内显示出高的抗菌活性。聚合酶在涉及原位药物释放的抗菌治疗乃至更广泛的生物医学方面有很好的应用前景。

作者：WG 审校：WH

Rotello, V. M. J. Am. Chem. Soc. 2020, 142, 10723-10729.

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.0c01758