分享一篇2023年发表在J. Am. Chem. Soc.上的文章，题目是“Thiomethyltetrazines Are Reversible Covalent Cysteine Warheads Whose Dynamic Behavior can be “Switched Off” via Bioorthogonal Chemistry Inside Live Cells”。文章的通讯作者是来自美国特拉华大学的Joseph M. Fox教授，其课题组致力于开发新型生物正交反应，应用于生物学、放射化学、成像、治疗和材料科学。
可以可逆修饰蛋白质的亲电小分子在药物发现中日益引起人们的兴趣。共价小分子探针通常以亲核残基为靶点，形成不可逆的共价键来抑制靶点以达到治疗效果。相对于非共价探针，共价探针具有高效、选择性强和作用时间长等优点。然而，在活细胞中研究可逆共价探针的能力可能受到细胞裂解后和蛋白质组学工作流程中的可逆反应性的限制，从而导致混乱和信号丢失（图1A）。为了解决这一问题，本文作者将硫代甲基四嗪描述为一类用于活细胞蛋白质标记的新型可逆共价探针，其可逆反应性可以通过生物正交化学反应“关闭”（图1B, C），这种新策略利用具有双重反应模式的探针，既可以作为亲电试剂，也可以作为生物正交试剂。当探针单独加入活细胞时，共价标记是可逆的。在生物正交反式环辛烯（TCO）作用下，四嗪迅速转化为二氢哒嗪产物，无法参与后续的亲核芳香取代（SNAr）化学反应，从而在细胞裂解和蛋白质组学工作之前将标签锁定为活细胞内的稳定共轭物，这样就能检测到在western印迹和蛋白质组学工作流程中可能丢失的目标。总而言之，硫代甲基四嗪具有三种不同的功能：（1）半胱氨酸的可逆共价SNAr弹头，（2）通过与TCO的反应可以“关闭”其可逆性以提供稳定共轭物的生物正交基团，（3）通过与TCO的相同生物正交反应引入荧光或亲和标签的手柄。
图1：A) 传统的RCP在细胞裂解和化学蛋白质组学分析过程中会出现标签混乱或丢失。B) 设想中的双反应探针，其取代化学可以被淬灭并锁定，以检测在化学蛋白质组学工作流程中丢失的可逆靶标。C) 这里介绍的是可用作可逆探针的硫代甲基四嗪，用TCO淬火后，产生一个稳定的标签。
接下来，该团队证明了硫代甲基四嗪在细胞裂解物中标记蛋白质的能力。他们制备了一个硫代甲基四嗪(A-H)的片段库，并将其用于检测HeLa细胞裂解物。然后，用a-TCO-TAMRA （350 μM）荧光标记被标记的蛋白（图2A, B）。观察到探针A−H的不同标记强度，表明硫代甲基四嗪的反应性可以调节（图2C）。在测试的探针中，探针A的反应性最强。这种观察结果可能是由于与四嗪核相连的4-吡啶基的亲电性增加。观察到荧光蛋白的剂量依赖性标记，证实硫代甲基四嗪探针的工具箱可以扩展到包括荧光衍生物（图2D）。当用BODIPY-Tz（一种缺乏硫代甲基四嗪亲电试剂的四嗪- BODIPY探针）重复标记时，没有观察到标记，这表明亲电的SMe基团的重要性（图2E）。
图2：A) 用硫代甲基四嗪片段库标记HeLa细胞裂解物中蛋白质的一般工作流程。B) 硫代甲基四嗪的片段文库。除F和G在DPBS中的溶解度极限分别为1 μM和10 μM外，其余四嗪的剂量均为100 μM。C) 比较硫代甲基四嗪片段库对细胞裂解物的标记。D) 用BODIPY-TzSMe对细胞裂解物进行探针标记。E) 以BODIPY-Tz为对照，对细胞裂解物进行探针标记。
综上所述，该团队描述了硫代甲基四嗪如何作为半胱氨酸修饰的可逆共价弹头，其可逆标记行为可以通过活细胞内的生物正交化学“关闭”。四嗪还可作为生物正交报告基因，用于引入荧光成像或亲和纯化的标签。硫代甲基四嗪具有二级速率常数（k2 = 1−100 M−1 s−1），跨越2个数量级，能够标记分离的蛋白质，细胞裂解物中的蛋白质和活细胞中的蛋白质。
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