摘  要：近二十年来，商业化的枯草芽孢杆菌生产核黄素是通过合理的基因重组和经典的菌种开发相结合而发展起来的，但是如何合理地创造一个改进的核黄素生产菌株还不完全清楚。在这项研究中，我们展示了综合基因组和转录组学分析在枯草芽孢杆菌中过量生产核黄素的遗传基础上的联合应用。该方法通过全基因组测序和转录组测序鉴定了突变源性核黄素产生菌B.subtilis 24/PMX45的阳性突变。其中包括RIBC（G199D）、RIBD+（G+39A）、PURA（P242L）、CCPN（A44S）、YVRH（R222Q）和两个无义突变YHCF（R90*）和YWAA（Q68*）。将这些特异性突变重新引入野生型菌株，恢复了核黄素生产过剩表型，随后的代谢工程大大改善了核黄素生产，使核黄素效价比测序生产菌株高出3.4倍。一个新的突变，YVRH（r222q），参与了一个典型的双组分调控系统，解除了嘌呤从头合成途径的限制，增加了细胞内嘌呤代谢产物的储备，从而增加了核苷的生产。综上所述，我们提出了一个结合基因组和转录组分析的案例研究，以阐明复杂细胞特性的遗传基础，使有益突变的转移可以作为设计过量生产工程菌的参考。

关键词：枯草芽孢杆菌核黄素突变分析基因组测序转录组分析代谢工程

1.  介绍                                                                               

通过靶向和非靶向菌株的改良作用，可以产生高性能菌株，这已被证明是构建具有所需表型菌株的有力工具。如果施加适当的选择压力，非靶向菌株的改良可以获得大量的基因型。这种非靶向的菌株优化方法包括：（i）传统的随机诱变和基因组重组(Gong et al., 2009; Peano et al., 2014; Stephanopoulos,2002; Zhang et al., 2002)；（i i）在培养条件下的适应性实验室进化（ALE），为更好的菌株提供了选择性优势。(Brown et al., 2011a; Caspeta et al., 2014;Fletcher et al., 2017; Horinouchi et al., 2017; Lam et al., 2014)；（iii）全球转录机械工程（GTME）(Alper and Stephanopoulos, 2007)，通过重新编程细胞转录组(Alper et al., 2006; Santos et al., 2012; Zhao etal., 2014)在引入表型多样性方面尤其有效。即使对生产菌株的遗传基础或生理学缺乏详细的了解，这种策略的有效性也是无可争议的。然而，由于诱变的不确定性，使用非靶向方法开发的菌株通常具有未知的遗传背景，进一步的改进通常会导致性能、增量增加缓慢，特别是在菌株改进的后期阶段(Dai and Nielsen, 2015) 。通过传统随机突变产生的菌株具有相对较高的非有益突变与有益突变比率，通常会导致在工业化生产所需的条件范围内表现不一致的“病态”菌株(Dai and Nielsen, 2015; Warner et al., 2009)。更糟糕的是，它的“黑匣子”特性阻止了在品种或物种之间快速转移相关的有益特性。

随着系统生物学工具的发展，尤其是下一代测序技术的发展，越来越多有潜在价值的突变被识别出来(Brown et al., 2011b; Garst et al., 2017; Huang etal., 2015; Krober et al., 2016; Lee and Palsson, 2010; Liu et al., 2014, 2017;Wang et al., 2014a; Yang et al., 2010; Zhang et al., 2015)其中一些已经成功转移到其他宿主菌株(Horinouchi et al., 2017; Lee and Palsson, 2010;Liu et al.,2014)。尽管这些重构可以恢复突变株的部分或大部分表现表型，但由于突变数量多，突变间的上位性相互作用，尤其是传统随机突变株的突变，仍然难以识别所有阳性突变。对于一个全面的突变分析，更广泛的了解基因组突变和转录变化之间的关系是必要的。通过整合全基因组测序（WGS）和转录组测序（RNA-Seq），我们能够获得基因组和转录组变化的全面预测，如每个受影响基因的点突变、不确定和基因融合，以指导后续的突变分析。

核黄素（维生素B2）是FMN和FAD的直接前体，是所有细菌、植物和动物所需的细胞生理学的基本成分之一。在枯草芽孢杆菌中，利用经典诱变、基因组变异和合理代谢工程相结合，实现了商业化核黄素的生产(Perkins et al., 1999; Revuelta et al., 2017; Schwechheimeret al., 2016; Wang et al., 2011, 2014b)。用化学或物理诱变的方法来设计枯草芽孢杆菌的核黄素生产，使菌株具有高核黄素生产能力，但产生了不清楚的遗传背景，这限制了我们进一步探索其巨大潜力的能力。到目前为止，很少有研究系统地分析了枯草芽孢杆菌的遗传特征与核黄素生产过剩表型之间的关系(Paracchini et al., 2017)。本研究的目的是确定引起核黄素生产过剩表型的特定遗传因素，以深入了解非靶向核黄素生产过剩突变体产生的内在机制。

2．材料和方法

2.1． 细菌菌株，培养基和试剂

本工作使用的细菌菌株列在补充表S1中。所有菌株在−80°C下储存，并通过在LB琼脂斜面上生长而复活。枯草芽孢杆菌24/PMX45是由枯草芽孢杆菌168经多轮筛选而得，其中8-氮杂鸟嘌呤（azr）、脱色素（dcr）和玫瑰黄素（rofr）用于解除对核黄素生物合成途径和嘌呤从头合成途径的抑制突变。它包含一个低拷贝数pSM19035衍生质粒pMX45，携带一个完整的rib操作子。采用大肠杆菌TOP10对质粒进行常规转化和维持。从Sigma Aldrich Corporation（美国密苏里州圣路易斯市Sigma Aldrich）购买5-氟Rouracil（5fu），作为100 mm二甲基亚砜（DMSO）储备溶液制备。限制酶和T4连接酶购自Thermo-Scienti-fic Corporation（Thermo-Scienti-fic，Rochester，USA）。Taq DNA聚合酶购自NEB（马萨诸塞州伊普斯维奇新英格兰生物实验室）。本研究中使用的抗生素和其他化学品是从西格玛-奥德里奇公司（西格玛-阿尔-德瑞克，密苏里州圣路易斯，美国）购买的。所有的化学药品都是试剂级的。Wang等人测量了生物量和核黄素浓度，并详细描述了最小培养基、摇瓶培养基和发酵程序（2011年）。必要时，在生长培养基中添加以下浓度的抗生素：100μg/ml氨苄西林用于大肠杆菌筛选；20μg/ml氯霉素用于谷氨酸棒杆菌筛选；100μg/ml大观霉素和5μg/ml红霉素用于枯草杆菌筛选。在最低培养基中进行生理特性鉴定，在摇瓶培养基中进行核黄素的生产。为了测试突变株的核黄素生物合成活性，将每株菌株的单个菌落转移到5 ml Luria Bertani（LB）培养基中，并在240 rpm的旋转摇床中41°C培养14 h，以制备接种物。将2%（v/v）接种物无菌添加到含有50 ml摇瓶培养基的500 ml摇瓶中。发酵在41°C的摇瓶中以240转/分的速度培养72小时。使用LBG培养基（1%葡萄糖的LB培养基）进行定量RT-PCR分析。MMedium用于细胞内代谢物分析(Wang et al., 2011)。含10μmol/L 5fu的mM培养基用于反选择5fu抗性菌落(Shi et al., 2013)。所有实验都是在三个平行中独立进行的，报告的结果代表三次重复实验的平均值。

2.2．质粒构建

本研究中使用的质粒和相应引物分别列在补充表S2和S3中。采用无标记基因突变传递系统高效构建枯草芽孢杆菌的不同突变体(Shi et al., 2013)。PSS质粒被用作重复突变传递的骨架（补充图S1）。用pcr扩增目标基因编码序列的上游和下游片段，分别插入pSS质粒的MCS-i和MCS-i i位点。对于帧内基因缺失，用pcr扩增目标基因编码序列的上游和下游片段，分别插入pSS质粒的MCS-i和MCS-i i位点。该程序用于CCPN、LYTC和YVRGH的中断。以pSS-Δccpn-f b为例，利用引物st-23f/st-24l从枯草杆菌168基因组中扩增ccpn上游片段Δccpn-f，用aatii-bglii消化，并与pSS的MCS-i连接。然后，利用引物ST-25F/ST-26L从枯草芽孢杆菌168基因组中扩增CCPN下游片段ΔCCPN-B，用Sali-kpni消化并连接到MCS-II中以产生PSS-ΔCCPN-FB。引物ST-24L和ST-25F设计成互补序列作为直接重复序列（DR），用于取出计数器可选择盒。质粒pSS-Δyvrgh-fb和pSS-Δlytc-fb的构建过程相同。

对于无标记突变传递，质粒构建的主要过程与基因缺失基本相同，只是在引物上引入了点突变。例如，质粒pSS-ccpn*-fb是为枯草杆菌基因组上ccpn基因（编码ccpn（A44s））的无标记突变而构建的。为了构建质粒pSS-ccpn*-fb，用引物对st-31f/st-32l和st-33f/st-34l分别扩增上游和下游片段，并分别插入pSS的MCS-i和MCS-i i位点。值得注意的是，点突变同时被引入上游片段的反向引物和下游片段的正向引物中。补充表S2中列出的所有用于引种的质粒都是用这种方法构建的。

携带IPTG诱导启动子的载体pec-xk99e用于质粒基因表达。为了构建质粒pec-xk99e-cgl3092，利用引物对lu-155f/lu-156l对谷氨酸棒杆菌atcc 13032的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶cgl3092基因进行了聚合酶链反应，用ecori和xbai对其进行了消化，并与pec-xk99e的相应位点结合。生成PEC-XK99E-CGL3092。

质粒pMUNTIN4被设计成通过坎贝尔型插入到克隆编码序列的染色体位点。净效果是将编码序列与其自然调节区域分开。编码序列置于IPTG诱导的pspac启动子的控制之下，允许在诱导存在和不存在的情况下比较表型。以pMUNTIN4-lytabc为例，利用引物lu-131f/lu-132l从枯草芽孢杆菌168基因组中扩增出操纵子lytabc的上游片段，用hindiii bamhi消化，并与pMUNTIN4的MCS连接生成pMUNTIN4-lytabc。PMUNTIN4 dltabcde、PMUNTIN4 sigx、PMUNTIN4 wapa和PMUNTIN4 wpra的施工采用相同的程序。

2.3. 菌种构建

采用无标记基因突变传递系统，在枯草芽孢杆菌中高效构建不同的突变体(Shi et al., 2013)。以BSW11为例，通过第一次双交叉染色体转化将质粒pSS-ccpn-fb整合到BSW9染色体中，用氯霉素筛选转化剂。接下来，将产生的转化剂在lb液体培养基中培养12小时，然后将细胞铺在含有10μmol/L 5fu的mm板上。用引物ST-31F和ST-34L对生长在5fu-mm平板上的菌落进行了PCR验证，并用Sanger测序证实了UPP盒被取出。在UPP盒回收事件发生后，将CCPN（A44S）编码序列导入CCPN位点，得到菌株BSW11。将相应质粒pMUNTIN4-lytabc、pMUNTIN4-dltabcde、pMUNTIN4-wapa、pMUNTIN4-wpra、pMUNTIN4-lytabc和pMUNTIN4-sigx整合到基因组中，用红霉素进行筛选，得到菌株BSW59到BSW62和BSW66。

对于谷氨酸棒杆菌菌株构建，使用电穿孔将质粒pEC-XK99E-Cgl3092引入谷氨酸棒杆菌Δ4-PPC（WT13032ΔldhAΔpqoΔcatΔptaPsod::ppc，包含pXMJ19-hemA）(Feng et al.,2016)。

2.4. 454焦磷酸测序和突变鉴定

枯草芽孢杆菌24 / pMX45的全基因组序列在454 GS FLXTitanium平台（Roche，Switzerland）上获得。使用商业细菌基因组DNA提取试剂盒（Tiangen，Beijing，China）从过夜培养物中分离基因组DNA。文库制备和测序严格遵循制造商的说明。使用GS NewblerAssembler（版本2.3，Roche）将读数组装成重叠群。通过使用ABI 3730毛细管测序仪（AppliedBiosystems，USA）通过Sanger测序填充缺口来完成完整序列。 GS Mapper（版本1.1.03，Roche）用于将焦磷酸测序读数映射到枯草芽孢杆菌168参考基因组（GenBank登录号：NC_000964.3）。通过PCR扩增和Sanger测序进一步验证小于100％的突变率。具有注释功能的ORF（开放阅读框）内的突变根据它们在代谢或调节网络中的功能和氨基酸的变化进一步分类。使用Subtilist数据库（http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/）鉴定围绕已知基因外突变的基因间隔区域，并使用DBTBS（http://dbtbs.hgc.jp/）进一步检查(Sierro etal., 2008)确定它们的位置，包括推定的启动子，转录因子结合位点和转录终止子。

2.5. RNA文库的制备和测序

在早期指数期收集在50ml LBG（LB补充有20g / L葡萄糖）培养基中生长的约1.5ml细胞用于RNA分离（对于BSW8，OD600 =0.90-1.00，对于枯草芽孢杆菌24，OD600 =0.50-0.60）。 pMX45）。使用Trizol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）提取总RNA的一式三份样品，并使用RNeasy清除试剂盒（Qiagen，Inc.，Valencia，CA，USA）根据制造商的说明进行纯化。使用TruSeq RNA样品制备试剂盒v2和TruSeq PECluster Kit V3（Illumina，Inc.，San Diego，CA）制备Illumina配对末端测序文库，然后在IlluminaHiSeq上测序。使用TruSeq SBSKit v3-HS（Illumina，Inc.，San Diego，CA）的2000仪器采用成对端（100bp×100bp）方法。使用bowtie /0.12.7对枯草芽孢杆菌168基因组（GenBank登录号：NC_000964.3）绘制处理的高质量读数。使用Rsem / 1.2.4（Li和Dewey，2011）计算基因表达的FPKM（基于每百万片段的每千碱基片段的片段）基因表达的值，并且使用DESeq /1.14.0（Bioconductorpackage）检测基因表达的统计学显着差异。，版本2.14）根据标准| log2折叠变化| > 1.0且p值<0.05。

2.6. 通过定量RT-PCR分析基因表达

在LBG培养基的指数生长阶段采集的新鲜细胞培养样品，按照制造商的说明，使用RNAPrep纯细胞/细菌试剂盒（中国北京天根）提取总RNA。用快速定量RT试剂盒（中国北京天根）与gdnase和随机引物合成cDNA。根据制造商的说明，在轻Cycler®480 II（瑞士巴塞尔罗氏）上使用真主混合物（SYBR绿）进行定量RT-PCR，如下所示：在20μl的总反应体积中使用100 ng cDNA，每种底漆使用0.25 mmol/l（见补充表S3）。每个样本中每个转录物相对于对照组的倍数变化以一式三份的形式进行测量，归一化为内部控制基因rRNA，并根据比较CT方法计算(Livak and Schmittgen, 2001)。

2.7. 代谢物浓度和酶活性的测定

Shi等人描述了用LC-MS/MS测量细胞内嘌呤代谢产物的细节（2014）。如Kang等人所述，使用改良的ehrlich试剂分析细胞外和细胞内5-ALA浓度（2011）。通过以下过程分析了细胞内氨基酸的测量细节。在晚期指数生长阶段（OD600≈3.0），在mm培养基（三个副本）中采集新鲜细胞培养样品。离心后，沉淀被清洗并被超声波破坏。然后用磺基水杨酸处理上清液，然后进一步离心去除蛋白质。用等量的0.02 N HCl重新悬浮所得提取物，并用0.45μm注射器过滤器过滤。氨基酸分析仪（日本日立L-8900）将日立高效液相色谱填充柱与2622号离子交换树脂pF（4.6×60 mm）和紫外检测器（vis1:570 nm，vis2:440 nm）连接，用于氨基酸分析(Yong et al., 2009)。根据钱等人的研究，测定了无细胞提取物中腺苷琥珀酸合成酶的活性（2006）。根据1分钟内1毫克酶提取物（(103ΔA280 min–1mg–1蛋白质）280纳米处吸光度增加1000倍计算特异活性。

3. 结果

3.1. 通过全基因组测序鉴定基因组变化

高通量测序技术使突变基因组的完全特征化，并有助于识别不同表型的相关突变。枯草杆菌24/PMX45在LBG培养基中的核黄素产生率为42.44±3.35μmol g−1 CDWH−1，产物收率为50.48±3.14 mg。为了确定该菌株核黄素生产过剩表型的遗传基础，采用热测序方法对枯草杆菌24/PMX45的基因组进行了重新测序（详见补充表S4和S5，以及材料和方法）。枯草芽孢杆菌24/PMX45共检测到506个高置信度差异（hcdiffs），由GS Mapper（Roche）确定。桑格测序检查了不到100%置信度的变异，以消除假阳性。结合GAPS中发现的突变，共鉴定了枯草杆菌24/PMX45基因组中513个突变，包括29个插入、20个缺失和464个替换。在ORF内发现459个突变，在非ORF区域发现54个突变（补充表S5，表1）。根据其在代谢或调节网络中的功能以及氨基酸的变化，对ORF内的突变进行分类（补充表S5，表2）。使用子列表数据库识别基因间间隔区内的突变，并使用DBTBS进一步检测其位置，包括假定的启动子、转录因子结合位点和转录终止子（补充表S5，表3）。在这些突变中，只有一小部分基因座具有与核黄素生物合成途径相关的注释功能。其中包括：CCPN（A44S）、YWDH（缺失）、中心碳代谢中的CITZ+（T148+A）、嘌呤从头合成途径中的PURA（P242L）、嘌呤从头合成途径中的PURC（K5N）、嘧啶代谢中的PyrC（N136S）、核黄素从头合成途径中的RIBC（G199D）和RIBD+（G+39A）。一些突变被认为占据了可能与该菌株表型相关的有趣位点。例如，编码参与同源重组和DNA修复的重组酶A的reca（g41d）可能是枯草杆菌24/pmx45自然转化效率低的原因。

图1. 枯草芽孢杆菌24 / pMX45中差异表达基因中显着富集的KEGG途径。 KEGG分析的富集p值截止值为p <0.05，使用修正的Fisher精确检验（EASE）评分计算，然后通过计算错误发现率（FDR）对多个假设检验进行校正

3.2.RNA-Seq表明了负责核黄素生成的突变的作用

如上所述，鉴定了大量的基因组变化，并且实际上不可能通过突变递送鉴定所有突变与核黄素过量产生表型之间的关系。为了获得正相关突变的一些迹象，特别是对于非编码或调节突变，进行了枯草芽孢杆菌24 / pMX45中不同表达基因的整合转录分析。构建并选择BSW8作为参考菌株，其含有两个报道的有益突变RibC（G199D）和ribD +（G + 39A）(Bresler etal., 1973; Kil et al., 1992)。使用中指数期细胞样品进行分析，其中枯草芽孢杆菌24 / pMX45和BSW8的特异性生长速率分别为0.74±0.08h-1和1.02±0.03h-1。共有945个基因在枯草芽孢杆菌24 / pMX45和BSW8之间的全基因组转录水平上显示出显着的变异（483个上调和462个下调基因;补充表S6），代表超过20％的枯草芽孢杆菌基因组（Pearson相关性） ≥0.95）。途径富集分析显示，一系列富集途径表现出显着的不同表达（图1和补充表S7）。

几乎全部表达的基因都落入不同的功能途径，包括代谢途径（153个基因），次级代谢产物的生物合成（89），ABC转运蛋白（63个基因），不同环境中的微生物代谢（53），氨基酸的生物合成（44）），双组分系统（39）和核黄素蛋白代谢（4）。毫无疑问，这一结果是由地理上分布在整个基因组中的各种突变引起的。为了进一步分析差异表达信息，我们首先关注与ribo fl avin生物合成直接相关的途径中的基因（图2）。在ribo fl avin生物合成代谢中，组织在单个操纵子中的rib基因的转录被5.40（ribD），6.73（ribE），5.88（ribA），7.22（ribH）和6.92倍（ypzK）强烈上调。枯草芽孢杆菌24 / pMX45。由于对照菌株BSW8已经具有这两种有益突变（RibC（G199D）和ribD +（G + 39A）），该观察结果与质粒pMX45相关，其含有过表达核黄素蛋白生物合成基因的rib操纵子。此外，除了枯草芽孢杆菌24 / pMX45中rib操纵子的更高表达外，参与前体供应的几个基因（甘氨酸，10-甲酰基-THF，GTP）呈现较低的表达水平。这些包括pur操纵子中的purD，purN，purLSQ，purM，purEK，purC，purB和purH，以及分别在一碳代谢和甘氨酸生物合成中的folD和glyA。因此，前体供应的不足可能限制了生物质积累和核黄素生成。可以选择这些基因作为代谢工程靶标以进一步增加核黄素的产生。途径富集分析还显示，参与中心碳代谢的大多数基因在枯草芽孢杆菌24 / pMX45中显示低表达水平。这些结果暗示通过中心碳代谢的碳和还原能量的流量，即葡糖异构酶发生和磷酸戊糖途径（PPP），可能是核黄素生成的另一个限制因素。这种推论已经在以前的报告中进行过(Shi et al.,2014; Wang et al., 2011, 2014b)，这些关键途径的遗传修饰确实增加了核黄素浓度。

图2. 参与核黄素生物合成的基因的表达谱的示意图;虚线上方或下方的数字分别是枯草芽孢杆菌24 / pMX45和对照中的比较表达水平的比率。蓝色表示下调，红色表示上调，黑色表示没有显着变化。 G6P，葡萄糖-6-磷酸; F6P，果糖-6-磷酸; FBP，果糖-1,6-二磷酸酯; DHAP，磷酸二羟丙酮; GAP，甘油醛-3-磷酸; PGA，3-磷酸甘油酸; PEP，磷酸烯醇 - 丙酮酸; PYR，丙酮酸;乙酰辅酶A，乙酰辅酶A; AKG，Oxoglutarate;柠檬酸，柠檬酸; ICit，Isocitric acid; Mal，Malic acid; Suc，琥珀酸; Fum，Fumarate; OAA，草酰乙酸; Ru5P，核酮糖-5-磷酸; X5P，木酮糖-5-磷酸; R5P，核糖-5-磷酸; E4P，Eerythrose-4-phosphate; S7P，Seduheptulose-7-磷酸; Ser，丝氨酸;甘氨酸，甘氨酸; 10-甲酰基-THF，10-甲酰基四氢叶酸; PRPP，5-磷酸-α-D-核糖基-1-焦磷酸酯; PRA，5-磷酸-α-D-核糖基胺; IMP，肌苷5'-单磷酸酯; XMP，黄嘌呤核苷5'-一磷酸; GMP，鸟苷5'-单磷酸; GDP，鸟苷5'-二磷酸; GTP，鸟苷5'-三磷酸; SAMP，succinyladenosine mono-phosphate; AMP，腺苷5'-单磷酸; ADP，腺苷5'-二磷酸; ATP，腺苷5'-三磷酸; Gln，谷氨酰胺; DARPP，2,5-二氨基-6-核糖基氨基-4（3H） - 嘧啶酮-5'-磷酸; ARPP，5-氨基-6-（5'-磷酸基氨基）尿嘧啶; ArPP，5-氨基-6-（5'-磷酸基氨基）尿嘧啶; ArP，4-（1-D-核糖基氨基）-5-氨基-2,6-二羟基嘧啶; DHPB，3,4-二羟基-2-丁酮4-磷酸酯; DRL，6,7-二甲基-8- ribityl-lumazine; FMN，黄素单核苷酸; FAD，黄素腺嘌呤二核苷酸。

为了确定导致核黄素产生过量的基因组变化，而不是简单地列举所有的突变并分别进行测试，我们在基因组序列和伴随表型变化的转录组变化中寻找线索。与核黄素融合途径相关的突变和转录分析中丰富的途径突变被认为是进一步验证的主要候选。例如，双组分系统（39）是主要的富集途径之一。因此，突变lytb（s239c；编码主要自溶素lytc的一种修饰蛋白）和yvrh（r222q；编码两个组成应答调节因子yvrh）都被选择用于进一步的研究。基于这个半理性的概念，选择了改变受影响蛋白质氨基酸序列或位于基因间区域的潜在有益突变，这些突变跨越了生产过剩突变中的许多生物学过程，并将其引入母体菌株中，以评估其对核黄素生成的影响（总结如表1所示）。最终，选择28个突变作为基因调控靶点，以评估它们对核黄素生产过剩的影响，其中24个位于氨基酸序列改变的ORF中，其余4个位于基因间区。

表1 鉴定了具有改变的氨基酸序列和位于基因间区域的潜在有益突变

a通过将枯草芽孢杆菌24 / pMX45的全基因组序列与枯草芽孢杆菌168的参考基因组比对来鉴定aMutations。通过Sanger测序再次确认所有突变。星号（*）表示无意义的突变。上标中显示的加号（+）和减号（ - ）表示位于基因间隔区的突变。该数字分别代表相对于转录起始位点或相对于终止子区域中的TAA的突变位置。

3.3识别有益突变及其与核黄素过量生产的联系

对参与核黄素融合途径的突变进行了初步鉴定和研究（图3c）。我们利用方法一节中描述的无标记突变传递系统构建了包含直接与核黄素代谢途径相关突变的对照菌株BSW12（图3a）。考虑到突变的可能性，基于BSW12鉴定了一系列突变体，并在摇瓶培养基中的摇瓶发酵中进行了研究（图3b）。至少有7种不同细胞途径的特异性突变被鉴定为有利于核黄素的过度生产，包括RIBC（G199D）、RIBD+（G+39A）、PURA（P242L）、CCPN（A44S）、YHCF（R90*）、YWAA（Q68*）和YVRH（R222Q），尽管其作用不同。此外，RIBC（g199d）、RIBD+（g+39a）、PURA（p242l）和YVRH（r222q）导致了核黄素分泌过剩的显著改善。携带RIBC（g199d）突变的菌株BSW5将核黄素的产生从几乎零提高到50.15±0.48 mg/l。同样，突变BSW8中的RIBD+（g39+a）进一步将核黄素的产生从50.15±0.48 mg/l提高到170.91±6.15 mg/l。令人惊讶的是，显著的突变yvrh（r222q）从未报道过，这一突变提高了R。IBO flavin产量比BSW12高23.4%（图3b）。

图3.获得性突变的适应性贡献

除了确定的有益突变外，还有一些被认定为中性甚至有害的。例如，LytB（S239C），PbuE（G361D），OppD（V357G），OpuCB（Y179C），ResE（T551I），FliG（D248N），CheR（V246A），SpoVAF（L48F），ywdH（缺失），citZ +（ T148 + A），PurC（K5N），DinG（Q735 *），FrlR（P29T），SigG-（G-7A），BkdR（Q2 *），RsmB（Q71K），PyrC（N136S）和TrmD（H227Y）分别为中性突变，在相应的突变体中没有可观察到的表型变化。 RecA（G41D）被认为是一种有害突变，并且可能导致枯草芽孢杆菌24 / pMX45自然转化的低效率，其仅达到每μg质粒DNA约1-3×10-2(Anagnostopoulosand Spizizen, 1961)。我们的研究结果证实，所选择的突变中只有7个突变对于核黄素蛋白的产生是有益的，占总突变的一小部分。

3.4.通过代谢工程重建核黄素过量产生菌

基于对有益突变的分析，我们尝试通过从头开始的迭代无标记突变递送系统重建核糖蛋白过量产生器。我们生产了一系列工程菌株，从BSW4到BSW55，具有清晰的遗传背景（图5）。含有质粒pMX45的菌株BSW55与有益突变一起产生更高的核黄素生成，包括RibC（G199D），ribD +（G + 39A），CcpN（A44S），YhcF（R90 *），YvrH（R222Q），YwaA（Q68 *）和PurA（P242L）。与BSW5相比，BSW55产生了大约16.4倍的ribo fl avin，相当于从50.15±1.55增加到980±22.85 mg/ L.事实上，重组菌株BSW55的核黄素产量是枯草芽孢杆菌24 / pMX45（1211.79±38.47mg / L）的80％，这表明通过组合基因组和转录组成功鉴定出与表型相关的大多数阳性突变。分析。然而，鉴定500多名候选人中的所有正面突变是艰巨的，几乎是不可能的。考虑到所有未确定的阳性突变似乎仅占观察到的表型差异的20％，我们决定使用进一步的理性代谢工程来改善菌株（图4）。

图4.  BSW50的合理代谢工程策略，用于进一步促进核黄素的生物合成。红色粗线表示该途径失调或上调，蓝线表示相应的基因失活或下调。

首先，我们用强组成型启动子P43替换ribA启动子，并在amyE位点整合额外的rib操纵子拷贝，以进一步过表达rib基因。其次，通过去除pur操纵子阻遏物PurR和含有鸟嘌呤感应核糖开关的pur操纵子的5'-UTR，通过去除嘌呤从头合成途径的调节来改善GTP供应。第三，将特异性突变体purF（D293V，K316Q和S400W）引入染色体以释放磷酸核糖焦磷酸酯（PRPP）氨基转移酶的反馈抑制，并且过表达prs-ywlF操纵子以增加PRPP合成酶活性。 GTP浓度逐渐增加，从0.044±0.012μmolgCDW-1增加到0.062±0.017μmolgCDW-1，从工程菌株BS89（BSW50，P43 :: ribA）到BS110的核黄素产量显着增加（ BSW50，P43::ribAΔpurRΔattP43:: purF D293V K316Q S400W）通过使嘌呤从头合成途径失调。因此，这种放松管制稍微影响了工程菌株的生长（从0.60±0.01h-1到0.45±0.01h-1）。第四，缺失guaC并且用强P43启动子替换guaB的天然启动子，目的是增加代谢流向GTP。发现这些修饰可以有效地增加核黄素的产生，同时恢复工程菌株的生长。第五，删除bdhA和cyd以分别减少向2,3-丁二醇的流动并提高能量形成效率（Dauner和Sauer，2001; Li等，2006）。最后，通过将额外的拷贝引入基因组（pSS-Rib）或通过携带rib操纵子的表达质粒pMX45进一步过表达rib操纵子。因此，基于菌株BSW50顺序构建BS110，BS120和BS125。 BS125（4232±34.42 mg/ L）的最终核糖产量比枯草芽孢杆菌24 / pMX45高3.4倍（图5）。

图5.重组核黄素过量生产菌株。为了简洁起见，基因名代表了相应的突变。条右侧的值表示在提供100 g/L葡萄糖的摇瓶培养基中，核黄素生产改善率相对于对照菌株BSW5。

3.5. 深入了解导致核黄素过量生产的突变

3.5.1． RibC（G199D）和ribD +（G + 39A）突变体极大地促成了核黄素过量产生表型。

在枯草芽孢杆菌中，rib操纵子在其第一个基因ribD前面具有300个碱基对的非翻译调节前导区。这种前导序列称为RFN元件（ribO），负责通过FMN结合对rib操纵子进行负调控。它通过转录或翻译机制阻止下游基因的表达(Nudler andMironov, 2004; Shi et al., 2009)。 RibC突变G199D是一种双功能核糖蛋白激酶/ FMN腺苷酰转移酶，它将酶的活性降低了95％，并导致低FMN库(Bresler etal., 1973)。保守调节RFN元件中的ribD +突变G39 + A显示出显着改善核黄素生物合成(Kil et al.,1992)。这可能是由于突变部分破坏了RFN结合FMN的能力。定量RT-PCR结果显示，与BSW4相比，BS操纵子和BSW8中rib操纵子基因的转录水平显着上调。事实上，ribD-ribE，ribA-ribH和ypzK的转录水平在BSW5中分别为55.33±3.55,57.85±4.12和59.2±3.21倍，分别为75.11±4.28,77.93±5.27和80.1±3.14倍。分别在BSW8中。因此可以得出结论，FMN库保持在低水平，并且肋操纵子在这两种突变体中高度上调。

3.5.2. 突变转录调节因子CcpN（A44S）在中枢碳代谢中的作用

gapB和pckA基因编码糖原异生所需的两种核心酶，并且它们的转录在糖酵解条件下在葡萄糖存在下由遗传阻遏物CcpN调节(Blencke etal., 2003; Servant et al., 2005)。缺失CcpN会损害葡萄糖上的细胞生长并强烈改变细胞内液体的分布，将主要的葡萄糖分解代谢从糖酵解转向磷酸戊糖途径（PPP）(Tannler etal., 2008a)。此外，通过阻遏物敲除对gapB和pckA的失调导致通过PPP的相对流量增加和更高的核黄素产量(Tannler etal., 2008b)。作为有益突变，CcpN（A44S）导致BSW7中核黄素生成增加约5.5％。删除BSW10中的CcpN可使核黄素产量提高20.9％。在基本培养基中，相对于BSW5，在BSW10中发现pckA和gapB的转录分别为48.62±4.33和41.93±2.85倍。相比之下，相对于对照，pckA和gapB在BSW7中仅上调了两倍。这些结果表明CcpN突变体A44S仅部分失去其功能。

3.5.3. 腺苷酸琥珀酸合成酶（PurA）突变P242L在嘌呤从头合成途径中的作用

嘌呤从头合成途径催化PRPP和谷氨酰胺通过10个不同的酶促反应转化为IMP，之后IMP可以转化为AMP或GMP。细胞内嘌呤核苷酸库在严格控制下维持，因此嘌呤从头合成途径受转录抑制和抑制机制的严格调节(Smith etal., 1994)。细胞外嘌呤负调节大多数编码ATP和GTP从头合成所需酶的基因的转录。反馈抑制通过终产物反馈调节影响PRPP氨基转移酶，腺苷酸琥珀酸（sAMP）合成酶和IMP脱氢酶的酶活性(Shi et al.,2014)。

PurA（P242L）被证明是核黄素过量产生的有益突变。特定酶活性的测定表明BSW6中的PurA（P242L）有缺陷。该突变在基本培养基中引起腺嘌呤营养缺陷型，并且通过添加腺嘌呤可以恢复细胞生长，表明由于腺苷酸琥珀酸合成酶的功能丧失，AMP / ADP /ATP的生物合成应该被阻断。另外，prs，purF和guaC的转录水平显着上调，进一步证实了BSW6中细胞内AMP / ADP /ATP的低库（补充图S2）。因此，腺苷酸琥珀酸合成酶的失活有利于GMP / GDP /GTP的合成，导致核黄素生成的前体供应增加。

3.5.4. 支链氨基酸氨基转移酶YwaA中无义突变Q68 *的影响

由于无义突变Q68 *导致YwaA预先终止，显然扰乱了YwaA的正确翻译并导致其失活。因此，它可能影响支链氨基酸的合成。同时，我们观察到参与支链氨基酸途径的基因在枯草芽孢杆菌24 / pMX45中显着下调（补充图S3），表明朝向该途径减少的流量可能对核黄素生成有益。如图S4所示，BSW50中细胞内的分枝链氨基酸减少。 BSW50中亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸的细胞内浓度分别为0.03±0.002,0.017±0.002和0.05±0.003 mgg CDW-1，低于0.038±0.003,0.021±0.003和0.053±0.004mg g CDW-1。 BSW49，分别。在枯草芽孢杆菌中，ybgE和ywaA都编码支链氨基酸氨基转移酶(Berger etal., 2003)。它们将支链α-酮酸（3-甲基-2-氧代戊酸酯，2-氧代异戊酸酯和4-甲基-2-氧代戊酸酯）转化为相应的支链氨基酸，然后可用作支化氨基酸的底物 - 链脂肪酸合成。为了进一步证实我们的假设，在BSW64中删除了ybgE，导致核黄素产量大约增加了15.3％，这进一步证明了我们的前述假设。

3.5.5. 新型YVRH突变体R222Q增加了细胞通透性，部分解除了嘌呤从头合成途径，促进了典型的双组分调节系统YVRH（R222Q）的产生，从而显著促进了核黄素的生物合成

为了进一步揭示YVRH（R222Q）与核黄素产生的关系，我们对BSW47与对照菌株BSW8进行了比较转录组分析，以分析转录过程中的差异。如补充表S8所示，BSW47上调36个基因，下调33个。在解除管制的基因中，7个正向调节的转录单位（wpra、wapa yxg、dltabcde、suna、sunt bdba yolj bdbb、yvri yvrha、rsoa sigo和rsix sigx）和1个负向调节的转录单位（lytabc）是yvrgh reg ulon的一部分(Serizawa et al., 2005)。这可能是突变YVRH（r222q）引起的，因为Lytb（s239c）被证明对核黄素的过度生产没有影响，并且在相关的途径或网络中没有发现其他突变。

构建了YVRGH空突变体BSW57，研究其特异性机制。与BSW8相比，YVRH（R222Q）和ΔYVRGH突变株在过渡期后的最小培养基中均表现出异常的自溶行为（补充图S5a），而ΔYVRGH导致了更高的核糖脂积累。异常的自溶行为表明YVRGH系统不能维持细胞包膜的正常功能，并且不能防止两种菌株的细胞自溶(Serizawa et al., 2005)。RT-PCR结果证实，Lytabc操纵子在ΔYVRGH中的表达水平高于YVRH（R222Q）突变株（补充图S6），从而得出YVRH（R222Q）部分丧失功能的结论。

为了探索YVRGH调节子中的哪一个基因调控是引起核黄素融合蛋白积累的原因，构建了BSW58、BSW59、BSW60、BSW61、BSW62和BSW66，分析了不同IPTG浓度下核黄素融合蛋白产生性能与基因表达水平的关系。这些菌株是通过整合pMUTIL4衍生质粒获得的（目标基因上游约350-450 bp被克隆到pMUTIL4中），导致目标基因lyta、dlta、wapa、wpra和sigx与pspac启动子染色体融合。图6表明，在没有IPTG诱导的情况下，BSW58和对照菌株BSW8之间的核黄素合成没有差异。相比之下，随着IPTG浓度的增加，核黄素的生成量也随之增加。在0.5毫摩尔/升的IPTG诱导下，BSW58的核黄素生成增加了11.2%，甚至高于BSW47。在BSW59、BSW60、BSW61和BSW66的发酵产物中，没有观察到核黄素生产性能的提高。根据这些结果，我们可以推断，Lytabc操纵子的过度表达是导致所观察到的核黄素过度产生的原因。此外，BSW63的核黄素产生量下降了约8.3%，而在没有IPTG诱导的情况下，BSW62与BSW8相比没有变化，这表明Lytc的过度表达是导致核黄素产生过量的主要原因。

图6. lytABC操纵子过度表达对核黄素产生的影响。

N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶（EC:3.5.1.28）lytc负责营养生长期间酰胺酶活性的大部分(Lazarevic et al., 1992)。它分解壁酸的内酰胺基和L-丙氨酸的氨基之间的酰胺键以释放肽部分(Lupoli et al., 2009)。由于Lytc的过度表达导致细胞自溶（补充图S5a），我们推断Lytc的过度表达导致细胞壁的部分降解，这可能导致细胞通透性的改变。为了验证我们的假设，当细胞处于指数阶段（OD600≈1.0）时，在mM培养基中添加1.0μg/ml溶酶体，以测试不同菌株的溶菌酶敏感性(Feng et al., 2016)。如补充图S5b所示，添加溶菌酶后，所有菌株的生长均下降，在一定程度上降低了生物量产量。而Lytc过表达的菌株BSW47和BSW57对低浓度溶菌酶的敏感性更高，说明这些菌株的细胞通透性更强。此外，还研究了细胞内氨基酸浓度的变化对细胞通透性的影响。与BSW8相比，除了谷氨酸外，观察到的所有细胞内氨基酸的浓度在Lytc过度表达突变体BSW47和图6中均降低。Lytabc操纵子过度表达对核黄素产生的影响。BSW57（补充图S7）。这些结果进一步证实了我们的推论，即细胞壁的部分降解影响了细胞的通透性，并导致了核苷的过度生产。巧合的是，我们发现嘌呤从头合成途径中的几个基因被上调。其中包括purf、purs、purl、purq、purm、purn、purh和purd。对BSW47中嘌呤从头合成的细胞内靶向代谢产物的分析表明，大多数嘌呤核苷酸的浓度，如IMP、GMP、GDP、GTP、AMP、ADP和ATP略有增加（数据未显示）。因此可以得出结论，细胞内核苷酸（GTP）的供应增加与BSW47中核苷的产生增加一致。此外，在两个突变体之间，未观察到显著差异。因此，我们推测，解除管制可能与pur operon的5′-utr有关，pur操纵子含有鸟嘌呤敏感的核糖开关(Mandal et al., 2003)。

4. 讨论

优秀生产菌株及其后代的比较基因组分析有助于识别有益突变，然后将其组合成健康的原始菌株或嵌入其他菌株中，以产生的强大生产菌株(Conrad et al., 2009; Lee and Palsson, 2010; Yanget al., 2010)。在目前的研究中，我们证明了利用多种“omics”方法组合来深入了解工业微生物的遗传特征的明显潜力，这使得能够产生令人鼓舞的重组菌株。分布在不同通路上的7个特异性有益突变能够有效恢复大多数生产过剩表型，而鉴定出的核黄素生产过剩的分子机制可用于改善类似的生物基产品。例如，pura（p242l）的突变阻碍了IMP向AMP的转化，有利于直接前体GMP/GDP/GTP的生物合成。因此，PURA（p242l）酶活性降低可能有助于在富培养基中合成鸟嘌呤衍生产物，如肌苷、鸟苷和叶酸。然而，PURA（p242l）在最小的培养基中引起腺嘌呤营养缺陷，加入腺嘌呤可以恢复细胞的生长。受pura（p242l）突变的启发，我们最近选择了渗漏突变pura（p242n），它在最小培养基中保持了生长能力，而核黄素产量提高了约28%(Wang et al., 2016)。此外，转录调节突变ccpn（a44s）或ccpn缺失将中央碳代谢的流向转向ppp。可尝试扩大应用范围，以生产直接来源于购买力平价的产品，以及其他需要NADPH的化合物的生物合成。

更重要的是，YVRH（r222q）部分丧失了功能，导致Lytc（N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸氨基酶）的过度表达，导致细胞外壳部分降解，进而影响细胞的通透性。实验结果证明，这一突变解除了嘌呤从头合成途径的管制，增加了部分细胞内嘌呤代谢产物（如核黄素生物合成前体GTP）的聚集，进而增加了核黄素的产生。为了扩大这种方法的应用范围，我们成功地通过N-乙酰胞壁酰-L-ALA-9酰胺酶的过度表达增加了工程化谷氨酰胺Δ4-ppc（在补充图S8中总结）中5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）的产生。如补充图S9所示，与对照菌株Δ4-ppc（pec-xk99e）相比，在0.5毫摩尔/升的IPTG诱导下，5-ALA的产量增加了约22.2%，最终浓度在补充了7.5克/升甘氨酸的CGIII培养基中达到2.81±0.04克/升。此外，最大生物量从5.10±0.05降至4.22±0.13 g/L，表明N-乙酰壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的过度表达在一定程度上影响了生长。定量分析细胞内5-ALA浓度显示，分别含有PEC-XK99E或PEC-XK99E-CGL3092的Δ4-PPC中有21.43±0.99和15.92±1.18 mg g CDW−1。细胞内5-ALA浓度的降低可能导致血红素副产物生物合成途径的流量减少，同时也减轻了5-氨基乙酰丙酸合成酶的抑制，从而改善了5-ALA的流量，并最终显著提高了产量(Kang et al., 2011)。在先前的研究中，通过添加青霉素抑制细胞壁合成已被证明是通过谷氨酰胺提高L-谷氨酸产量的有效策略(Laneelle et al., 2013)。同样，进一步证实，改变细胞通透性可用于促进5-ALA的产生(Feng et al., 2016)。这一扩展应用表明，通过过度表达N-乙酰基村上酰-L-丙氨酸酰胺酶来调节细胞通透性可能为生物化学物质的过度生产提供一种新的广泛适用的策略，特别是在生物合成受到反馈或变构抑制机制的严格调控的情况下。

尽管有超过28个假定有益的突变被鉴定出来，但相对于祖先，只有一小部分的突变占重组菌株中核黄素过度生产表型的80%。虽然在剩余的484个未识别的突变中可能存在其他未知的有益突变，但我们认为，搜索仅占20%产量增加的如此多的突变是不现实的困难。然而，为了全面了解核黄素生产过剩的枯草芽孢杆菌的遗传特征，一些背景信息有限的有益突变仍值得在未来的研究中对其分子机制进行详细分析。例如，本研究发现的Gntr家族转录调节因子YHCF无义突变R90*可能改变了其调节蛋白的结合动力学和基序，从而改变了调节网络的拓扑结构。

对于枯草芽孢杆菌中的核黄素生产过剩，解除核黄素生物合成途径的管制和主要前体（GTP和RU5P）的供应被认为是必要的，并已被广泛研究。从重组菌株BSW50开始，只有几个有益的突变和已知的遗传背景，我们采用有效的代谢工程策略来进一步增加核黄素的产生。我们的合理方法极大地提高了核黄素的产量，导致菌株BS125中核黄素的最终积累量约为4.2 g/l，远高于使用已建立的工业菌株B.subtilis 24/PMX45获得的量。因此，我们证明了肋骨操纵子和嘌呤从头合成途径的放松调控是导致核苷产生过量的关键因素。然而，构建一个更强大的核黄素过量生产商需要额外的代谢工程，包括进一步提高GTP供应(Shi et al., 2009, 2014)和将碳流从糖酵解转向PPP(Duan et al., 2010; Wang et al., 2011; Zamboniet al., 2005)等。

5.结论

作为一个案例研究，我们采用WGS和RNA-Seq相结合的方法分析了产核黄素的枯草芽孢杆菌菌株的遗传特征。一些有益的突变被识别并重新引入野生型菌株，成功恢复了大多数高性能表型，利用遗传数据库中的宝贵数据对工业微生物的高效利用是有益的。更重要的是，一些新发现的突变显示了在其他生物化学合成中潜在的有价值的应用。最有趣的是，YVRH（r222q）介导的细胞通透性增加或N-乙酰壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的表达分别增强了枯草杆菌和谷氨酸棒杆菌中核黄素和5-氨基酮戊酸的产生。因此，这些结果可能为生物化学物质的生产提供一种新的广泛适用的策略，特别是在生物合成受到反馈或变构抑制机制的严格调控的情况下。此外，这项研究还说明了一种高效的方法来研究目标表型的分子基础，并提高我们在全基因组范围内进行基因型-表型相关性的能力。

致谢

我们非常感谢张春亭和高峰教授（天津大学）宝贵的帮助和热心的讨论。感谢河北制药厂对枯草芽孢杆菌24/PMX45菌株的捐赠。本研究得到了国家自然科学基金（NSFC-21576200、NSFC-21576191、NSFC-21776209和NSFC-21621004）和郑州轻工业学院博士研究生科研基金（No.2015BSJJ018）的支持。

原文标题：《Integratedwhole-genome and transcriptome sequence analysis reveals the geneticcharacteristics of a riboflavin-overproducing Bacillus subtilis  》

原文出处：MetabolicEngineering

涉及核黄素