近日，华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室白云鹏副教授课题组在英国皇家化学会期刊  Chemical Communications  上发表题为“Reshaping the active pocket of promiscuous lactonases for degrading bulky organophosphate flame retardants” 的封面论文(Outside Front Cover)。该工作报道了一种整细胞生物传感器高通量筛选和活性口袋半理性设计相结合的策略，用于具有催化混乱性的内酯酶定向进化，将其改造成第一个能够降解大位阻有机磷阻燃剂的人工酶，实现了酶催化偏好性的完全重构。

有机磷阻燃剂是橡胶、纤维、发泡剂、润滑剂等工业产品的主要添加剂，在汽车、家具、电子产品、建筑物中广泛应用。与其他有机磷化合物相比，有机磷阻燃剂含有位阻较大的苯基取代基，磷脂键不易断裂，在环境中难以降解，造成环境污染和公共健康危害。目前，只有来源于鞘氨醇单胞菌属的磷酸三酯酶 Sb-PTE 能够降解有机磷阻燃剂，但其自然进化的路径尚不清楚。

从具有催化混乱性的内酯酶出发，通过定向进化获得新的催化活力是创制新酶的有效思路。通过序列比对和结构分析，作者发现课题组之前报道的内酯酶 POOPH_M2 (Biotechnology Bioengineering, 2016, 113, 2350-2357)的活性口袋虽然和 Sb-PTE 不相似，但都含有两个金属催化中心，周边是 6 或 7 个疏水性氨基酸残基，作者推测两者具有催化功能上的相似性。Kamerlin 等人证明具有相似的催化中心和催化机理的酶也可能具有截然不同的催化偏好性。作者提出补充性的假设，即使底物结合口袋不相似，也可以通过定向进化重塑 POOPH_M2 的活性口袋，使其具有催化有机磷阻燃剂降解的能力。

野生型 POOPH_M2 催化三苯基磷酸酯(TPHP)降解的初始活力仅有 0.03 U/g，生成的产物苯酚紫外吸收较弱，无法进行有效筛选。作者设计构建了基于整细胞生物传感器的高通量荧光筛选技术，能够有效区分不同活力的酶突变体，在模拟筛选中使 10⁴ 的酶突变库中的有益突变体富集能力提高 100 倍，解决了极低活力的酶难以高通量筛选的难题，为该酶定向进化奠定了基础。

作者通过分子对接，确定了底物结合口袋附近敏感的氨基酸位点，经过 3 轮的随机突变和定点饱和突变的迭代，获得了比活力提高 1007 倍的突变体 PoOPH_V5 (V55I/D56V/L57G/M188F/W263S)，动力学测定发现该酶的底物结合能力大幅提高(K_M 0.23 mM)，催化转化数 k_cat 为 12.3 s^-1，与自然酶 Sb-PTE 为同一数量级。降解反应表明该酶突变体可催化 10 mM TPHP 在 24 小时内完全降解，而野生型酶在 48 小时内只降解了 0.24%，实现了催化偏好性的重构。

分子对接结果显示，M188F、V55I 和 D56V 的突变位于两个侧链结合口袋，突变后疏水性增加，提高了酶与 TPHP 中苯环的亲和力，稳定了底物构象。L57G 和 W263S 位于产物离去通道，突变后氨基酸残基的位阻变小，亲水性增加，有利于产物苯酚的离去。这些突变的协同作用使酶的活力大幅提高。

作者发展了基于整细胞生物传感的高通量酶定向进化技术，使酶的筛选效率提高 100 倍，酶的催化效率提高 1007 倍，解决了极低活力酶难以筛选的问题，获得了首个降解有机磷阻燃剂的人工酶，与天然酶相比具有催化功能的相似性和结构的新颖性，实现了酶催化偏好性的完全重构。

本文报道的研究工作受到国家重点研发计划青年项目(2016YFA0204300)、国家自然科学基金面上项目(22078096)，上海市自然科学基金(18ZR1409900)的资助。华东理工大学硕士毕业生张媛媛为第一作者，硕士毕业生程欢和生物工程系张晓彦为共同第一作者，清华大学戈钧教授为共同通讯作者。

• Reshaping the active pocket of promiscuous lactonases for degrading bulky organophosphate flame retardants. 
  Yuanyuan Zhang (张媛媛), Xiaoyan Zhang (张晓彦), Huan Cheng (程欢), Mario Roque Huanca Nina, Jun Ge* (戈钧，清华大学) and Yunpeng Bai*(白云鹏，华东理工大学)
  Chem. Commun., 2021, 57, 6475-6478.
  http://doi.org/10.1039/D1CC02657G

  

  
  

张媛媛

华东理工大学

华东理工大学生物工程学院 2020 届级硕士毕业生，现任上海复旦张江生物医药股份有限公司纯化制剂偶联研究员。

程欢

华东理工大学

华东理工大学生物工程学院 2018 届硕士毕业生，现任上海药明生物技术有限公司蛋白纯化研究员。

张晓彦

华东理工大学

华东理工大学生物工程学院教师，主要研究方向为微生物酶学。

戈钧 教授

清华大学

清华大学化学工程系长聘教授，博士生导师。分别于 2004 年，2009 年在清华大学化学工程系获得本科和博士学位，2009 年至 2012 年在斯坦福大学化学系进行博士后研究，2012 年开始在清华大学化学工程系工作。主要从事生物化工、酶催化剂工程研究。

白云鹏 副教授

华东理工大学

现任华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室副教授、博士生导师，生物工程系主任。主要研究方向为生物催化与微反应工程，以第一作者或通讯作者在 PNAS, Biosens. Bioelectron., Chem. Commun., J. Agric. Food Chem., Lab Chip 等国际学术刊物上发表论文近 30 篇，申请中国专利 13 项（已获授权 3 项，实现技术转让 2 项），主编《生物反应工程原理》教材 1 本，获 2020 年中国化工教育协会优秀教学成果一等奖(第 2)。