为进一步促进行业的绿色可持续发展、解决日益严重的环境问题，“绿色化学12原则”被制药界广泛推崇。其中，生物酶催化技术是实现绿色化学的最佳解决方案之一（图1），与传统化学合成相比具有诸多优势：生物酶催化避免使用有毒催化剂，可以使反应在温和条件下进行，产生较少的副产物和三废，有效缩短合成路线，提供更高的催化效率和立体选择性，实现低成本、高质量生产。生物酶催化技术作为绿色化学的重要组成部分，已成为现代生物学和化学交叉领域里最活跃的研究领域之一，许多生物转化工艺已经广泛应用于重磅药物及药物关键中间体的生产中。

图1. 绿色化学12原则和生物酶催化的优势

特别是基于现代基因工程技术领域的突破，酶的适应性和稳定性得以显著提升。在解决制药行业环境问题过程中，有多种生物催化剂可用于药物和药物中间体的合成，包括氧化酶、还原酶、水解酶、裂解酶、异构酶和转氨酶等。本文以最为常见的氧化反应和还原反应为例，简述生物酶催化技术在药物合成中的应用。

              氧化反应              

生物氧化反应目前已被广泛用于制药行业，人们正越来越多地探索将氧化酶用于生物催化。例如，丙肝病毒蛋白酶抑制剂telaprevir和boceprevir以及质子泵抑制剂埃索美拉唑在工业生产中都使用了氧化酶。又如，植物雌激素松脂醇在多种疾病过程中都能对机体起到保护作用，因此制药界对它的研究颇多。有报道称利用青霉菌（Penicillium simplicissimum）的香草醇氧化酶和细菌漆酶，使用价格低廉的丁子香酚做为起始原料，用两步一锅法合成松脂醇。在优化的条件下，松脂醇的合成可以达到1.6g/L的半制备规模（图2）。

图2. 利用香草醇氧化酶和细菌漆酶通过串联反应合成松脂醇

              还原反应              

使用生物酶催化剂对羰基官能团的区域选择性和立体选择性具有很好的效果，尤其是在还原合成手性药物中间体过程中具有重要意义。例如新的微生物菌株从环境中被分离出来，它们具有良好的羰基还原活性以及所需的生化特性，包括热稳定性和对有机溶剂的耐受性。

光学纯的叔丁基6-氰基-（3R，5R）-二羟基己酸酯是立普妥（阿托伐他汀钙）的关键手性前体，是由6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯通过还原酶还原生成的。有报道称在乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）中发现了一种新的羰基还原酶KlAKR，能够不对称还原6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯（图3）。并利用半理性设计策略改善酶的活性，经过两轮基于同源建模和分子对接的位点饱和突变筛选得到的突变体Y295W/W296L，催化效率比野生型KlAKR高11.25倍。

图3. 还原酶KlAKR催化的还原反应

除此之外，还可通过基因组挖掘新的生物酶催化剂，比如有报道称通过分析Yarrowia lipolytica ACA-DC 50109的基因组序列，鉴别出了NADPH依赖性羰基还原酶YlCR2，它可以将乙基4-氯-3-氧代丁酸乙酯（COBE）还原成乙基（S）-4-氯-3-羟基丁酸酯（(S)-CHBE），而(S)-CHBE是一种合成他汀类药物的关键中间体。值得一提的是，使用共底物甘露醇或山梨糖醇，Y1CR2既可用于COBE还原也可用于NADPH自动生成。这种只用一种酶的底物偶联辅因子再生系统比传统双酶偶联系统简单得多。在优化条件下，利用过表达Y1CR2的大肠杆菌（Escherichia coli）细胞合成(S)-CHBE在10小时内可以达到90％的产率和99％ee。

通过筛选新的微生物，或通过基因组挖掘鉴别出新的基因，然后再通过强大的酶工程工具，包括理性设计、非理性设计、高通量筛选平台等对这些生物酶进行优化和筛选，不断开发新的酶催化剂。不仅开发出新的酶还要找到发挥其活性的环境并应用到合适的反应中去。

他汀类药物的一个关键共同中间体BHA（手性二醇侧链）的合成使得他汀类药物结构中两个手性中心得以构建，因此它的合成是他汀类药物合成中的一个关键技术点，也是该类药物生产成本较高的原因。

凯莱英医药集团（股票代码：002821.SZ，以下简称“凯莱英”）技术团队开发了一条全新的BHA合成路线（图4），应用生物基因工程技术生产出高合成选择性的酶，实现手性二醇的一次性引入，突破国外专利限制，大幅降低了成本，有效减少了三废生成量。

图4. 二酮还原酶还原BHA的反应

在该酶的开发中，凯莱英技术团队通过基因突变提高了二酮还原酶的热稳定性、溶剂耐受性、底物耐受性、活性和非对映选择性等性能；并通过优化组合筛选寻找最佳表达系统，获得可溶性表达量最大的质粒及宿主组合，以提高酶制剂的合成效率，以适应工业化生产菌株的需要。在此基础上，结合高密度发酵技术，对获得的菌株进行高密度发酵，从而获得大量二酮还原酶，用于酶转化反应的优化及放大。

生物酶催化技术的成功应用优化了他汀类药物关键中间体合成工艺，发挥了生物技术高选择性和环境友好的优势，突破了传统工艺路线的专利壁垒，有效降低了生产成本，从而得以深度参与国际竞争。此外，相关技术还可广泛应用于各种具有自主知识产权的高活性工程酶、非天然氨基酸、药物中间体及原料药的生产中，商业化应用前景广阔。

凯莱英在生物酶催化技术领域持续投入与深耕多年，不断研发更高效的生物酶催化剂。生物酶催化技术平台覆盖酶的筛选、进化、生产、底物合成、生物转化以及原料药生产，开发出包括酮还原酶、转氨酶、氨基酸脱氢酶、腈水解酶、烯烃还原酶、单加氧酶、酯酶等在内的多种工程酶。目前已经将高活性、多品种的工程酶成功运用于他汀类药物、格列酮类药物、培南类药物等多种重磅药物的商业化生产之中。

过去几十年中，生物酶催化技术的发展对精细化工和制药行业起到了巨大推动作用，与传统化学合成相比，生物转化反应新工艺更环保、可持续性更强。未来，生物酶催化技术将在药物生产中实现更加广泛的应用，惠及患者与社会。

参考资料：

Huihua Sun et al.,(2018) Biocatalysis for the synthesis of pharmaceuticals and pharmaceutical intermediates. doi: 10.1016/j.bmc.2017.06.043